基因工程的基本操作

    基本操作包括目的基因(即外源基因或供体基因)的制取，载体系统的选择，目的基因与载体重组体的构建，重组载体导入受体细胞“工程菌”或“工程细胞株”的表达、检测以及实验室和一系列生产性实验等。

(一)获取目的基因

    取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为目的基因。目的基因可以人工合成，也可以用限制性核酸内切酶从基因组中直接切割得到。目前获取目的基因的方法主要有三种：①从适当的供体生物包括微生物、动物或植物中提取；②通过逆转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA)；⑧用化学方法合成特定功能的基因。

(二)选择载体

    载体必须具备下列几个条件：一个有自我复制能力的复制子；能在受体细胞内大量增殖，有较高的复制率；载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上；载体上必须有一种选择性遗传标记，以便及时把极少数“工程菌”选择出来。目前原核受体细胞的载体主要有细菌质粒(松弛型)和^噬菌体两类。真核细胞受体的载体动物方面主要有sV40病毒，植物方面主要是Ti质粒。

(三)目的基因与载体DNA的体外重组

    即用人工方法，让目的基因与载体相结合形成重组DNA。首先对目的基因和载体DNA采用限制性内切酶处理，获得互补黏性末端或人工合成黏性末端，然后把两者放在较低的温度(5℃～6℃)下混合“退火”，由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段的黏性末端有相同的核苷酸组分，所以当两者相混时，凡黏性末端上碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双链。这时，在外加连接酶的作用下，供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被“缝合”，目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。

(四)DNA重组体导入受体细胞

    上述体外反应生成的重组载体只有将其引入受体细胞后，才能使其基因扩增和表达。受体细胞可以是微生物细胞，也可以是动物或植物细胞。把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多。若以重组质粒作为载体时，可以用转化的手段；若以病毒DNA作为重组载体时，则用感染的方法。

(五)受体细胞的繁殖扩增

    含重组DNA的活受体细胞，在适当的培养条件下．能通过自主复制进行繁殖和扩增，使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加，从而使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状，受体细胞就成了“工程菌”。

(六)克隆子的筛选和鉴定

     把目的基因能表达的受体细胞挑选出来，使之表达。受体细胞经转化(传染)或传导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，需要对克隆子进行筛选和鉴定。

    (七)“工程菌”或“工程细胞系”的大规模培养采用生物工程技术将多种微生物的降解性基因从细胞中取出，然后组装到一个细胞中，使这个菌株集多种微生物的降解性功能的降解性基因从细胞中取出，然后组装到一个细胞中，使这个菌株集多种微生物的降解性功能于一身，同时可以降解多种化合物。这样的菌株我们称为工程菌。

    工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。

    来源：北纳细胞网www.bncc.org.cn