基本定向生化试验

     在细菌鉴定过程中，需要最先完成的一些实验称为基本定向生化试验。以下详细介绍这些基本定向生化试验的原理、操作步骤和试剂配制的内容。

     一、革兰染色试验

    (一)原理

    由于革兰阳性细菌的细胞壁较厚，细胞壁中的肽聚糖含量高且网格结构紧密，含脂量又低，当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色剂脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了结晶紫一碘复合物的逸出，故而菌体呈现深紫色；而革兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，当用酒精脱色时，脂类物物质被溶解，细胞壁通透性增大，结晶紫一碘复合物被抽提出来，从而使菌体呈现复染液的红色。

     (二)染色液的配制

     1．结晶紫染液将A液(结晶紫2.0g溶于20ml 95％乙醇中)与B液(草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水)混合，静置48小时后过滤。

     2．卢戈(Lugol)碘液取碘化钾2.0g溶于5ml蒸馏水中，再加入碘片1.0g，待碘全部溶解后，加蒸馏水至300ml即成。也可只加蒸馏水至100ml，配成母液储存，用时加两倍蒸馏水。

    
     3．脱色液95％的乙醇溶液。

     4．复染液(0.25％的沙黄液) 取沙黄0.25g溶于95％乙醇10ml中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。

     (三)制片、染色操作

     在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌龄为18~24小时的菌苔与水滴充分涂抹混匀成1cm×1cm大小区域的菌膜，自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过几次，以固定涂片。滴加结晶紫液，初染1分钟，用自来水冲去结晶紫液。滴加卢弋氏碘液冲去残水并媒染约1分钟后，再用自来水冲去卢戈碘液，将玻片上的水甩干。滴加95％乙醇脱色约20~30秒，并立即用水冲净。滴加沙黄液染1~2分钟后，用水洗净沙黄液，晾干供镜检。

     (四)阳性一阴性对照控制

     取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液，制成细菌涂片；或是使用已知的革兰阳性细菌和阴性细菌制成涂片，分别染色操作后作为阳性和阴性的对照控制。

     (五)镜检观察

     在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本，菌体呈红色为革兰阴性菌；菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。观察菌体的状态、排列，(分辨并描述是（球菌、杆菌、弧菌、放线菌)和大小(用已标定过大小的目镜测微尺测量菌体大小)等。

     二、3％氢氧化钾试验

     (一)原理

     在碱性溶液(3％KOH)中，革兰阴性细菌的细胞壁会快速破裂，细胞内的脱氧核糖核酸被释放到碱性溶液中使溶液的粘性增强并形成粘丝；而革兰阳性细菌的细胞壁在碱性溶液中不会被溶解，细菌均匀地分散在碱性溶液中不会产生粘性。本实验用于当革兰染色实验不确定时，有助于进一步判断结果，但是它不能代替革兰染色实验，也不能仅以该实验的结果来确定革兰染色实验结果。

     (二)材料

     3％KOH溶液(W／V)木质牙签、待检菌的新鲜纯培养物(18~24小时)。

     (三)操作

     在一洁净的载玻片上等距离滴上3滴3％KOH水溶液；用铜绿假单胞菌或具有等同反应的菌种作为阳性对照；用枯草芽胞杆菌或具有等同反应的菌株作为阴性对照；用木质或塑料接种环从培养基上分别挑取阳性，阴性和待检菌的新鲜纯培养物(18~24小时)于载玻片上的3滴KOH水溶液中，然后用接种环快速环形搅动30~60秒后，用接种环轻轻地向外拉该菌悬液，如果是革兰阴性细菌，在菌悬液和接种环之间有粘丝出现，如果是革兰阳性细菌则无粘丝出现。

     (四)结果判断

     如果在15秒钟之内溶液的粘性增强并有粘丝形成，则认为该试验菌株的氢氧化钾试验呈阳性，试验菌株为G^一；如果溶液不产生粘丝，则试验菌株被判断为氢氧化钾试验阴性，试验菌株为G⁺ 。但是必须当阳性和阴性实验结果均为典型反应时，该实验才有效。

     三、接触酶试验(过氧化氢酶试验)

     (一)原理

     细菌代谢产生的过氧化氢对细菌细胞具有毒副作用，而细胞内的接触酶能催化过氧化氢，将其分解为分子态氧，使其解毒。向含有接触酶的细菌培养物滴加过氧化氢溶液后即产生大量气泡(阳性)。

     (二)材料

     3％过氧化氢溶液、洁净载波片、无菌木质牙鉴。

     (三)操作和结果判断

     用无菌木质牙鉴挑取新鲜待检菌的纯菌苔置于洁净的载玻片上。向玻片上的菌落滴加3％过氧化氢溶液一滴；或于琼脂培养物上直接滴加3％过氧化氢试液。立即观察结果，产生气泡为阳性反应，不产生气泡者为阴性反应。用金黄色葡萄球菌或具等同性质的菌种重复以上步骤作为阳性对照，并用铜绿假单胞菌或具等同性质的菌种作为阴性对照。

     在这个试验中，除了阳性控制和阴性控制必须为典型反应时，该实验才能有效以外，还应注意以下几点才能保证结果的正确性：

     1．当将过氧化氢酶溶液加到生长于血琼脂平板上的菌落时会产生假阳性结果(因为红细胞中含有过氧化氢酶)。

     2．必须将过氧化氢酶溶液滴到菌落上，操作顺弃不能颠倒，否则会产生假阳性结果。

     3．不要用铂金类接种针或接种环去混合培养物和过氧化氢酶水溶液，因为接种针的铂金可能会引起假阳性结果。因此在这个试验中，应用木质无菌牙签或是塑料类无菌接种环。

     四、葡萄糖氧化／发酵试验

     (一)原理

     氧化发酵培养基中含有较低浓度蛋白胨和较高浓度碳水化合物，待检细菌通过氧化或发酵利用葡萄糖产酸。使pH值下降，培养基中的溴麝酚蓝指试剂由绿色变成黄色。

     (二)材料

     无菌矿物油和氧化发酵培养基：葡萄糖10g，胰蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，琼脂4g，溴麝酚蓝0.08g，去离子水1000ml，pH 6.6~7.0。分装小试管中，121℃灭菌15分钟。竖直放置待其凝固后使用。

     (三)操作

     无菌操作，打开小试管。用接种针挑取分离的单个纯菌落，刺入氧化发酵培养基约1cm深，分别接种两个试管。向其中一只试管内加入无菌矿物油，覆盖在培养基表面约1cm高，作为发酵管(OF／F)；另一支不加矿物油作为氧化管(OF／O)。以同样的方法在安瓿中接种大肠杆菌或者是等同菌株作为阳性对照控制，安瓿中接种铜绿假单胞菌或者是类同菌株以作阴性对照控制。

     (四)培养

     将接种后的发酵培养基放人35~37℃的培养箱中培养24小时后读数，若结果呈阴性，则继续培养24小时。

     (五)结果判断

     培养基变为黄色，反应结果记为阳性。培养基仍保持均匀的绿色，反应结果记为阴性。如果培养基的颜色由绿色变为蓝色，是由微生物产碱反应所致，记为阴性。微生物利用葡萄糖的类型见表17—2。

     五、细胞色素氧化酶试验

     (一)原理

     细胞色素氧化酶是一种铁卟啉类的酶，它将还原的细胞色素C氧化后以非活性的还原态存在。而还原的细胞色素氧化酶因将电子传递给分子氧而又变成活性态。在分子氧的存在下，细胞色素氧化酶和细胞色素c系统能还原一系列有机物。其中，它将指不条反应区的α-奈酚和二甲基对苯二胺还原，会形成吲哚酚蓝分子，通过这一反应将细菌进行分类和鉴别。

     (二)材料

     细胞色素氧化酶检测指示条,指示条反应区的主要成分：二甲基对苯二胺0.1μmol，α-奈酚。

     (三)操作和结果判断

     用牙鉴从培养基上挑取生长良好的单一菌落(菌落的pH值不得低于6.0，否则会出现假阴性结果。)将菌落均匀涂在反应带上，过20~60秒后，比较反
应带的颜色。若反应带变为紫到深紫色则为阳性反应，不变色或黄色为阴性反应。

     来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com