无血清培养基

     细胞在体外培养的生存环境是人工模拟的，除了必须提供适当的温度、空气、无菌等条件外．最重要的是使细胞赖以生存的培养基接近于体内的生理环境，保证细胞能够正常地生存、生长，并维持其结构与功能。培养基的种类很多，按其来源分为天然培养基和合成培养基，按其基质状态分半固体培养基和液体培养基等。

     体外培养的细胞直接生活于培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。

     一、无血清培养基

     无血清培养基即不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时问生长繁殖的合成培养基。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养实验的要求．但对有些实验却不适合。如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用．而血清中可能含有各种生长因子；需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)的能力；要大规模地培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。

     1．无血清培养基的设计思路

     在无血清培养基的研制过程中有几种策略。

     (1)分析血清的成分：对细胞生长、生存所需的每一种血清成分进行分离鉴定的工作最后以失败而告终。因为许多激素、生长因子需协同作用并且在血清中含量极少。还有许多人们还不了解的成分，根本无法用常规的生化方法分离提纯。

     (2)采用合成的方法：根据不同细胞的特点，在现有的基础培养基中添加不同组合的各种生长因子、各种激素、结合蛋白质以及贴壁和扩展因子以替代血清的作用。

     (3)寻找限制因素：Ham等在研制无血清培养基时，首先将现有培养基进行新的处方设计．然后降低血清浓度，直到细胞生长受到限制，再调整培养基中每种成分的浓度，直到细胞恢复生长。

     设计无血清培养基，一定要了解所培养的细胞，是正常有限细胞系，还是永生不死或转化的细胞．是来自上皮组织还是结缔组织，或是肌肉组织等。同时要了解培养这种细胞的目的．是要保持其不分化状态或向一定方向分化，还是希望得到其分泌产物等。与基础培养基不同．无血清培养基的针对性很强，一种无血清培养基一般只适合于一种细胞的培养。

     2．无血清培养基的基本配方

     无血清培养基由基础培养液及添加组分两大部分组成。基础培养液以 Ham F 12和 DMEM 最为常用，一般两者以 1：1 混合。添加组分包括以下几类物质。

     (1)促贴壁物质：许多细胞必须贴附于瓶壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般是细胞外基质，如纤连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要的作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层的贴壁和分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、肌原细胞等。而层粘连蛋白主要促进内皮细胞以及来自内胚层的细胞贴壁和分化，如表皮细胞、支气管上皮细胞、分泌型上皮细胞、神经细胞和肝细胞等。

     (2)促生长因子及激素：针对不同的细胞添加不同的生长因子，如培养角质细胞添加表支生长因子(EGF)，培养神经细胞添加神经生长因子(NGF)，培养内皮细胞添加内皮细胞生长因子(ECGF)等。当然有些生长因子可以刺激多种细胞的生长，表2一4总结了部分生长因子的使用情况。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质。有些激素对于许多细胞是必不可少的，如胰岛素。还有一些激素对特定的细胞有重要的作用，如泌乳素对乳腺上支细胞。

     (3)酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必须含有酶抑制剂，以终止胰酶的消化作用。达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。

     (4)结合蛋白和转运蛋白：常见的有转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加量比较大．可增加培养基的黏度，保护细胞免受机械损伤。许多用于旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。

     (5)微量元素：硒是最常见的。

     以下是一种无血清培养基的基本配方：DMEM：F 12 = 1：1(V/V)，转铁蛋白 5μg／ml，纤粘连蛋白 1μg／ml，胰岛素 5μg／ml，硒 30mm0L／L，牛血清蛋白 1mg／ml，EGF 25ng／ml，大豆胰酶抑制剂 1～5mg/ml。

     3．使用方法

     细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度．从10％减少至5％、3％、1％，直至无血清培养。在逐步降低的过程中要注意观察细胞形态是否发生变化．是否有部分细胞死亡．存活的细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验或生产完成之后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞在转入无血清培养基培养之前，应留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。

     来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com