细胞脱核技术原理

    细胞拆合是把核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质、细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。细胞拆合有物理和化学两种方法。物理法就是用机械方法或短波光把细胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操作仪进行操作。

    化学法就是用松胞菌素质B处理细胞，使细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞分拆为核体和胞质体两部分。由于核体外表包有一层细胞膜和少量胞质，因而在PEG或仙台病毒的介导下，核体可同另一胞质体融合，形成重组细胞。

    显微操作技术是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。现在显微操作装置的设计越来越精密，不仅用于核移植，而且亦可对细胞核进行解剖和向核内注入基因。显微操作器还可以把细胞核、精子、DNA、RNA、基因片段、细胞质等直接注射到另一个细胞(卵细胞或去核的卵细胞)中去。如目前的动物克隆、人工授精等(图6-9、图6-10)。

    细胞脱核是近年来发展的新技术，即用特殊方法把细胞核从细胞中分离出来，形成无核的胞质体和无胞质的核质体两个部分。可用以做各种研究，如融合、胞质和胞核中成分分析等。

    (一)细胞脱核技术原理

    1967年Cater发现松胞菌素质B(CB)有一种特殊效应，在用低浓度的CB(1～5μg/ml)处理细胞时有抑制胞质分裂而不抑制核分裂的作用，从而能诱发多核细胞。剂量增大则细胞膜破裂。1971年Poste和Reeve用CB脱掉了小鼠腹腔巨噬细胞40%~80％的核。在这些工作的基础上，产生用组织培养细胞脱核技术。当把细胞培养在玻璃或无毒塑料板上，用CB作用后，再经高速离心处理，由于离心力作用可脱掉大量细胞核，本法较为常用。

    1964年发现松胞菌素共有6种，其中以CB效果最好。除上述作用外，CB还能抑制细胞运动，但用正常培养液洗涤后仍能恢复正常。CB为杂环化合物，在一般条件下比较稳定，溶于二甲基亚砜中4℃可储存三年。

    离心分离须把细胞培养在圆形无毒的聚苯乙烯(polystyrene)塑料板上，厚度需1~1.5mm塑料板太薄离心时易碎。塑料板的大小依据所用离心管的直径而定，一般要比离心管直径稍小1~1.5mm为宜，这样当把它置人管中离心时比较稳定。用直径大的离心管较好，这样生长的细胞多，脱出核的量也就多些。另外，在圆板的两侧要有两个凹陷．以便用镊子挟取。为使圆板在离心管中保持平衡和防止离心时发生翻转，需在离心底部放置一个圆筒状垫圈，亦由无毒塑料制成高2～2.5cm、壁厚2cm，其外径应和培养圆板的直径相同。

    离心时先把柱形的垫圈投入离心管中，然后再把圆板送人管中盖在其上(令细胞面朝下)。则圆板稳固地扣在垫圈上面，然后加人CB，量一定要超过圆板，使细胞能浸在CB中受到作用。因此垫圈不能过高，过高需加大CB量，造成浪费。如圆板和垫圈为塑料制品，用前宜用96％，乙醇漂洗5~10min，无菌蒸馏水漂洗2～3次，再用紫外线分别照射两面各10～15min后即可使用。

    来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com