分子生物学检验技术

  分子生物学技术的快速发展与完善，为微生物检验提供了一个新的途径，使诊断更加快速、简便和准确。

  (一)核酸杂交技术

  DNA两条链之间依靠氢键将互补核苷酸连接起来，当DNA受热时，两条链之间的氢镬打开，分解成两条核苷酸单链，此过程称为变性。在适当条件下，分开的两条单链又借碱基的互补性通过氢键恢复成双链，此过程称为复性。若来自两个不同个体的单链DNA相互结合成互补的DNA双链，这个过程则称为杂交。利用这一特性，将特定序列的DNA片段用酶、荧光物质或放射性核素标记作为探针，在一定条件下，探针与待测细菌中的DNA按碱基互补原则杂交，通过检测杂交信号鉴定标本中有无相应微生物的基因。该技术特异性强、敏感、简便、快速，已用于细菌毒素、耐药基因以及结核分枝杆菌、空肠弯曲菌、衣原体等检测。

  (二)聚合酶链反应

  聚合酶链反应(PCR)是一种模拟天然DNA复制过程的DNA体外扩增技术，又称无细胞分子克隆技术。应用这种技术可在数小时内将研究的基因或片段扩增百万倍，从微量的样品中获得足够的DNA供分析研究之用。PCR技术敏感、简便、快速，特异性高，己成为细菌学研究的有力工具之一。只要选择合适的引物，所有细菌都可用PCR进行检测。但绝大多数细菌感染，通过细菌培养3～4天即可出具报告并明确药敏结果，此类病原体不推荐用PCR技术检测。对于目前传统培养方法需时长，敏感性太低，或者不能培养的病原体，适于应用PCR技术进行检测。如结核分枝杆菌培养需2～5周才出现可见菌落；麻风分枝杆菌迄今不能人工培养，麻风病的病原诊断依靠从组织活检中取材作抗酸染色镜检，阳性率很低；沙眼衣原体感染时常无特殊症状，而且常规培养颇为困难，不易得到及时诊治和预防控制。其他如军团菌、肺炎支原体、立克次体等，PCR技术为此类病原体快速检测提供了新的手段。此外，PCR技术在细菌的毒素基因如霍乱肠毒素、肠毒素型大肠埃希菌产生的LT和sT基因等、耐药基因检测及流行病学调查中也得到日益广泛的应用。

  荧光定量PCR技术(RT-PCR)由PCR技术发展而来，克服了PCR技术易产生假阳性的不足，而且能准确定量。目前，RT-PCR在血流感染致病菌检测方面不断研发新产品，有些试剂盒可在6小时内直接检测25种血流感染常见的致病菌和真菌，在HBV、HCV、HIV等病毒检测方面也有广泛应用，详见第三章病毒检验技术。

  (三)生物芯片技术

  生物芯片是近年来发展起来的一项新技术，通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，可对基因、蛋白质、细胞及其他生物组分进行大信息量的检测分析。常用的生物芯片有基因芯片和蛋白质芯片。

  1．基因芯片基因芯片也称DNA微阵列，是将已知的核酸片段按特定的排列方式固定在硅片、玻片或塑料片表面，制成核酸探针，利用碱基互补原理，使其与待测DNA样品进行杂交反应，从而获得需要的生物学信息。一张芯片上可集成有成千E万密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息。检测病原菌的芯片技术对靶基因的选择有两种策略：一种是选择细菌的核糖体基因(如16S rRNA)，另一种是选择细菌的“特异基因”。基因芯片也可用于病原微生物耐药基因的表达谱检测、突变分析等。目前，应用于阳性血培养物的商品化基因芯片有的可在1小时芹右检测包括mecA、vanA、vanB、kpc耐药基因及革兰阴性菌、革兰阳性菌和酵母菌在内的27种病原菌。芯片技术为临床感染疾病的实验诊断提供了一个快速、灵敏、准确、高通量的检测平台。

  2．蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chips)是按特定排列方式，在经过特殊处理的硅片、玻片、塑料片等同相材料表面固定了许多蛋白质分子，这些蛋白质分子可以是抗原、抗体及配体等，可检测相应的抗体、抗原及蛋白质。

资料来源：中国微生物菌种网：www.bnbio.com