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重组子筛选实验技术
4579 人阅读发布时间：2016-05-30 14:46
经过基因重组实验技术获得的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量地复制、增殖和表达。依据所采用载体的种类，重组DNA分子导入受体细胞可采用不同的方法，包括转化、感染、转导、显微注射和电穿孔等。转化和转导主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。
重组DNA分子导入受体细胞后，一般只有少数的受体细胞能够获得重组DNA分子并进行稳定的增殖和表达，所以筛选工作是非常必要的，筛选出含有重组DNA分子的群落，并鉴定重组子的正确性。鉴定正确的细菌或细胞通过培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝，以便继续研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物，因此，如何筛选重组子至关重要。
重组子的筛选方法是多种多样的，这由载体的类型、插入DNA片段大小和性质，以及受体细胞的遗传特性等因素决定，下面简单介绍几种方法。
在构建重组DNA载体时，一般会设计一定的遗传标记基因，利用这些标记，能够将重组子筛选出来，即在选择性培养基中进行培养，通常是由LB培养基中加入了适量的选择物配制而成，也有的是营养缺陷培养基。
一、抗药性筛选法
如果克隆载体携带有受体细胞敏感的抗生素抗性基因时，转化后只有含这种抗药基因的重组子细菌才能在含该抗生素的平板上存活，这样即可筛选出重组子。常用抗生素有：氨苄西林、羧苄西林、甲氧西林、卡那霉素、氯霉素、链霉素、萘啶酸和四环素等。
二、显色筛选法
最常用的显色筛选法是蓝白斑筛选法，该筛选法利用LacZ基因的a-互补原理。很多载体都携带一段细菌的LacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为a-肽。载体转化的宿主细胞为LacZ ∆15基因型，它表达β-半乳糖苷酶的c-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有B一半乳糖苷酶活性，使特异的底物x-gal变为蓝色化合物，这就是a-互补。由a-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在显色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，破坏了LacZ的N端片段，a-互补也遭到破坏，因此使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。用蓝白斑筛选，连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置过夜培养，有重组质粒的细菌会形成白色菌落。
有的目的基因在受体细胞中表达后产物本身就具有某种颜色，利用这种性质可以直接进行重组子的筛选。只是在基因工程中，转化原核受体细胞的目的往往是扩增目的基因，不会表达，所以该法受到限制。即使能够表达，由于大肠杆菌中不具备真核基因的转录后加工机制，很难得到具有活性的产物。
三、营养缺陷型筛选法
营养缺陷型筛选法基因原理是：突变型受体细胞上缺乏合成某种必需营养物质，而载体分子上携带了这种营养物质的生物合成基因，利用缺少该营养物质的合成培养基进行涂布培养时，阳性转化子能够长出菌落。比如已经诱变产生的合成Lys的缺陷型菌株为受体细胞，当载体分子上含有Lys合成基因时，转化后利用不含Lys(即Lys-)的选择站养基即可筛选得到转化子。
四、噬菌斑筛选法
X噬菌体在感染细胞时，培养平板上会产生噬菌斑，利用这种特性，DNA重组载体在转染受体菌时，能够形成噬菌斑则为转化子，非转化子正常生长不会形成噬菌斑。该方法有时可以结合蓝白弱筛选直接得到重组子。也可以利用X噬菌体包装时对DNA长度限制的特性选用取代型载体，此时因为空载体不能被包装，所以得到的噬茵斑即为重组子。
五、菌落或噬菌斑原位杂交
它是先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后用标记的特异DNA探针进行分子杂交，挑选阳性茵落。该法能进行大规模操作，一次可筛选多达5X 105 ～ 5X 106 个菌落或噬菌斑，特别适于从基因文库中挑选目的基因。
为了进一步确定重组子韵正确性，可以采用内切酶图谱鉴定和菌落PCR的方法鉴定经过初筛的重组子菌落。内切酶图谱鉴定主要是将菌落进行小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片段；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。
菌落PCR鉴定重组子的操作比较简单，比如可以挑10个菌落，先准备好含转化子抗性的液体培养基10管，再准备好扩增插入DNA片段的PCR体系，也是10管。注意此处PCR时一般选择多克隆两侧的序列设计引物。下一步在超净台里用牙签挑取菌落，然后先在准备好的含转化子抗性的液体培养基中蘸几下以进行培养，再在相对应的PCR体系中蘸几下作为模板进行PCR扩增。扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带大小与目的DNA片段大小一致，即可初步认为得到了正确的目的DNA重组体，相对应的EP管中的菌可以进行菌种保存和进一步鉴定，进一步准确地鉴定一般是进行DNA序列测定和比对。
来源：北京标准物质网：www.biaowu.com
重组DNA分子导入受体细胞后，一般只有少数的受体细胞能够获得重组DNA分子并进行稳定的增殖和表达，所以筛选工作是非常必要的，筛选出含有重组DNA分子的群落，并鉴定重组子的正确性。鉴定正确的细菌或细胞通过培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝，以便继续研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物，因此，如何筛选重组子至关重要。
重组子的筛选方法是多种多样的，这由载体的类型、插入DNA片段大小和性质，以及受体细胞的遗传特性等因素决定，下面简单介绍几种方法。
在构建重组DNA载体时，一般会设计一定的遗传标记基因，利用这些标记，能够将重组子筛选出来，即在选择性培养基中进行培养，通常是由LB培养基中加入了适量的选择物配制而成，也有的是营养缺陷培养基。
一、抗药性筛选法
如果克隆载体携带有受体细胞敏感的抗生素抗性基因时，转化后只有含这种抗药基因的重组子细菌才能在含该抗生素的平板上存活，这样即可筛选出重组子。常用抗生素有：氨苄西林、羧苄西林、甲氧西林、卡那霉素、氯霉素、链霉素、萘啶酸和四环素等。
二、显色筛选法
最常用的显色筛选法是蓝白斑筛选法，该筛选法利用LacZ基因的a-互补原理。很多载体都携带一段细菌的LacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为a-肽。载体转化的宿主细胞为LacZ ∆15基因型，它表达β-半乳糖苷酶的c-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有B一半乳糖苷酶活性，使特异的底物x-gal变为蓝色化合物，这就是a-互补。由a-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在显色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，破坏了LacZ的N端片段，a-互补也遭到破坏，因此使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。用蓝白斑筛选，连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置过夜培养，有重组质粒的细菌会形成白色菌落。
有的目的基因在受体细胞中表达后产物本身就具有某种颜色，利用这种性质可以直接进行重组子的筛选。只是在基因工程中，转化原核受体细胞的目的往往是扩增目的基因，不会表达，所以该法受到限制。即使能够表达，由于大肠杆菌中不具备真核基因的转录后加工机制，很难得到具有活性的产物。
三、营养缺陷型筛选法
营养缺陷型筛选法基因原理是：突变型受体细胞上缺乏合成某种必需营养物质，而载体分子上携带了这种营养物质的生物合成基因，利用缺少该营养物质的合成培养基进行涂布培养时，阳性转化子能够长出菌落。比如已经诱变产生的合成Lys的缺陷型菌株为受体细胞，当载体分子上含有Lys合成基因时，转化后利用不含Lys(即Lys-)的选择站养基即可筛选得到转化子。
四、噬菌斑筛选法
X噬菌体在感染细胞时，培养平板上会产生噬菌斑，利用这种特性，DNA重组载体在转染受体菌时，能够形成噬菌斑则为转化子，非转化子正常生长不会形成噬菌斑。该方法有时可以结合蓝白弱筛选直接得到重组子。也可以利用X噬菌体包装时对DNA长度限制的特性选用取代型载体，此时因为空载体不能被包装，所以得到的噬茵斑即为重组子。
五、菌落或噬菌斑原位杂交
它是先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后用标记的特异DNA探针进行分子杂交，挑选阳性茵落。该法能进行大规模操作，一次可筛选多达5X 105 ～ 5X 106 个菌落或噬菌斑，特别适于从基因文库中挑选目的基因。
为了进一步确定重组子韵正确性，可以采用内切酶图谱鉴定和菌落PCR的方法鉴定经过初筛的重组子菌落。内切酶图谱鉴定主要是将菌落进行小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片段；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。
菌落PCR鉴定重组子的操作比较简单，比如可以挑10个菌落，先准备好含转化子抗性的液体培养基10管，再准备好扩增插入DNA片段的PCR体系，也是10管。注意此处PCR时一般选择多克隆两侧的序列设计引物。下一步在超净台里用牙签挑取菌落，然后先在准备好的含转化子抗性的液体培养基中蘸几下以进行培养，再在相对应的PCR体系中蘸几下作为模板进行PCR扩增。扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带大小与目的DNA片段大小一致，即可初步认为得到了正确的目的DNA重组体，相对应的EP管中的菌可以进行菌种保存和进一步鉴定，进一步准确地鉴定一般是进行DNA序列测定和比对。
来源：北京标准物质网：www.biaowu.com