蛋白质定量方法

390 人阅读发布时间：2016-06-12 17:04

1.蛋白质在溶液中的浓度测定

(1)氨基酸分析：将纯化蛋白质彻底降解成氨基酸后分析20种氨基酸相对的量并计算比例。如果被纯化的蛋白质是已知蛋白，那么氨基酸分析的结果也能昭示此蛋白是否被纯化。由于现有技术能够精确测定一特定氨基酸的量(纳摩尔级)，所以从氨基酸比例分析的数据又可以得出蛋白质精确的定量。下面介绍的蛋白质定量方法大都需要利用光吸收，所以不可避免受特定残基特别是芳香族氨基酸在蛋白质的丰度或溶液中其他组分的影响。因此迄今为止氨基酸分析还是最佳的蛋白质的定量方法。

(2)利用280nm的光吸收：此方法基于芳香族氨基酸(色氨酸与酪氨酸)以及处于二硫键态的半胱氨酸在280nm的光吸收即A280；灵敏度在20～3000μg／ml之间。

(3)利用205nm的光吸收：此方法是基于寡肽或多肽每个残基间的肽键都有在此波长的吸收即A205；灵敏度在1～100μg／ml之间。

(4)利用荧光散射：此方法是基于色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸有内在的荧光散射：通常测定的是来自色氨酸的荧光。灵敏度介于5～50gg／ml之间。

(5)Bradford方法：蛋白质可与染料Coomassle brilliant blue(考马斯亮蓝)结合，结合产物在可见光595nm达到吸收峰值。在1～10μg蛋白质的范围之内(通用比色杯)，光吸收呈线性分布。

(6)Lowry方法：蛋白质里的酪氨酸可以与染料Folin—iCocalteu phenol(福林酚)结合，结合后的产物在可见光750nm达到光吸收峰值。在1～20μg蛋白质的范围之内(通用比色杯)，光吸收呈线性分布。

2.蛋白质在细胞内的丰度测定

一般使用蛋白质印迹技术(immuno-blotting or Western blotting)。先用含有SDS和还原剂的缓冲液制备细胞裂解液；再把所有溶解的蛋白用含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳分开；然后是利用电转移方法把蛋白质转到膜载体上。被转移的蛋白质结合在膜的表面，使得免疫检测成为可能。首先是利用BSA或者脱脂奶粉溶液把膜上非专一性结合位点饱和阻断；然后用第一抗体与膜培养使之专一性地结合于固定在膜上的抗原；经过温和冲洗后，抗体-抗原的复合体可以被带有酶标签的第二抗体检测到。最后，膜在经过洗脱之后还可以重新用于检测其他抗原。

来源：北京标准物质网 www.biaowu.com

来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com

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