单核细胞增生性李斯特氏菌检验流程分析

　　【来源/作者】北纳创联 

　　
　　(1)检测流程

　　依据《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》(GB4789．30—2010)的规定．LMO的检验流程如图3—18所示。

　　(2)检测原理

 
　　LMO生长缓慢，如果在选择性差的培养基中很容易被其他生长快的细菌掩盖，所以它的增菌没有从非选择性增菌开始．而是一开始就用选择性增菌肉汤。LB₁和LB₂中的选择性网子是萘啶酮酸、吖啶黄和氯化钠。吖啶黄对LMO的生长只有轻微抑制，但能强烈抑制革兰氏阳性球菌的生长；萘啶酮酸能几乎完全抑制革兰氏阳性细菌的生长繁殖，而对LMO影响极小；LMO具有较高的耐渗性，高浓度的氯化钠能抑制肠球菌的乍长。

　　目前还没有对受损的LMO没有任何抑制作用的选择性培养基。添加选择性因子可以抑制人址背景菌的生长．同时也势必会延缓LMO的恢复和繁殖。

　　PALCAM琼脂是常用的分离LMO的平板培养基，李斯特氏菌在其上被区分出来是基于β一D一葡萄糖苷酶的活性。这种酶裂解培养基中的七叶甙．产生灰绿色菌落，然后通过降解产物七叶苷原与铁离子反应，在所有种类的李斯特氏菌菌落周围产生棕黑色晕圈。这个培养基不能将LMO与其他李斯特氏菌区分开。

　　GB 4789．30 2010中允许同时使用另一种显色培养基，国内常用的是cHROMagar^TMListeria。这种培养基能直接区分出LMO菌落，基于LMO具有毒力基因plcA和β一D一葡萄糖苷酶。该培养基中加入了这两种物质相关的底物，LMO能形成蓝绿色、周围有白色沉淀的菌落。伊氏李斯特氏菌虽然也有plcA，但因为它数量极少，即使有也能有效减少其他四个种的干扰。

　　至此，我们已经对目标物缩小到极小的范围，再进行协同溶血试验(cAMP)、血平板穿刺、木糖和鼠李糖试验。就基本可以确定可疑菌落是否是LM0。如果有商用的生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统的帮助就更方便准确了。

　　(3)应注意的问题

　　1)前增菌

　　 LB₁增菌24h后观察，增菌肉汤看起来是清亮的，好像没有生长任何微生物。如果轻轻震荡增菌液，就会发现在底部会有少量浑浊物出现，增殖的菌体都沉淀在底部，这和LMO的特性有关系。它在繁殖的时候，细胞经常黏在一起，容易形成细胞团块，增加了比重．容易下沉。在TSA—YE平板上培养LMO的单菌落，用接种环转接的时候，经常会将整个菌落挑起，如果想只挑取少量菌体不太容易，整个菌落就像一个整体，不用力是切不断的。其他的致病菌．例如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，它们在平板上的菌落质地相对松散，细胞之间的结合不紧密，很容易就能从菌落上取出少量的菌体。因为LMO的这个特点，在从LB₁增菌液向LB₂转接的时候，应该先将增菌液震荡摇匀，然后再吸取0．1mL转接，或者直接从第一增菌液的底部吸取0．1mL。这样可以防止漏检，提高检出的比率。

　　2)温度的选择作用

　　LB₁增菌液和LB₂增菌液的培养温度都是30℃。常见的致病菌增菌温度一般为36℃．而LMO能在低温缓慢生长，在4℃的冰箱中也能繁殖，所以在增菌的时候降低温度．适应LMO的生长特性，可以提高其在增菌液环境中的占比；这个温度又不太低．保证了LM0的生长速率，不至于繁殖太慢。所以在增菌的时候一定要注意控制好温度，不能随意提高。

　　3)非选择性平板的分离纯化

　　如果在非选择性平板上分离纯化LMO，只能用TSA YE。LMO的营养要求高，生长缓慢。TSA—YE的营养成分高于TSA、营养琼脂、BHI，如果LMO在其他非选择性平板上分离，可能不生长，或者只能长出针尖儿大小的菌落，相对于在TSA—YE上的菌落小得多。

　　4)选择性平板

　　标准中使用的选择性培养基上，目标菌都会在菌落周围产生沉淀环。如果整个平板被沉淀覆盖，非目标菌可能生长在沉淀区域，使得区分目标菌出现困难。这就要求检验人员在划线分离时必须保证单菌落分得较开，减少沉淀区的覆盖面积和相互交叉。

　　来源：北京标准物质网 www.biaowu.com

　　来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com