球红假单胞菌原生质体的制备与再生

　　【来源/作者】北纳创联 

　　1. 菌种

　　Rhodopseudom。nas sphaeroides，由中国矿业大学提供。

　　2. 培养基

　　基础培养基(g／L)：’K₂HPO₄3．0．K₂H₂PO₄1．0， ( NH₄ )₂NO₃ 0．5·Na₂S0₃ 0．1，MgSO₄·7H₂0 0．01，MnSO₄·₄H₂0 0．001，CaCI₂ 0．0005，FeSO₄·7H₂O 0．001．酵母膏0．1，葡萄糖10．0．乙酸钠5．0，蒸馏水1000mL，pH 7．0。

　　固体培养基：液体培养基+2％琼脂。

　　高渗再生培养基：固体培养基+20％蔗糖。

　　3. 生化试剂

　　Tris—HCI缓冲液(T缓冲液)：25m10．2mmol／L Tris + 27．5ml 0．1mmol／L HCl，加蒸馏水稀释至100mL pH8．0。

　　EDTA溶液：EDTA溶于T缓冲液中。

　　溶菌酶：溶于T缓冲液中，pH8．0，使用前抽滤除菌。

　　4. 原生质体形成率、再生率计算

　　原生质体形成率 = ( A — B ) ／ A × 100％

　　原生质体再生率 = ( C — B ) ／ ( A — B ) × 100％

　　A：未经酶处理的菌液在固体培养基平板上，28℃培养7d生长的菌落数；

　　B：经酶处理后的菌液在固体培养基平板上，28℃培养7d生长的菌落数；

　　C：经酶处理后的菌液在高渗再生培养基平板上，30℃培养3d生长的菌落数。

　　5. 原生质体的制备

　　将球红假单胞菌接种于基础培养基中，28℃培养过夜，再以l5％的接种量转接到新鲜液体培养基中，振荡培养6 h，移1 ml。菌液于离心管内，10000 r／min离心5min，用T缓冲液洗涤菌体3次后，按正交试验设计表，取蔗糖浓度(蔗糖溶于T缓冲液中)、溶菌酶浓度、EDTA浓度和酶反应时间四个因素，各因素分为3个水平，正交试验安排，试验因素及水平见表5一l。正交试验表头设计采用L₉(3⁴)。试验中不考虑各因素间的交互作用，试验结果如表5—2所示。试验结束后，以10000r／min的转速离心5 min，除去溶菌酶，用高渗(T)缓冲液洗涤沉淀3次，将生成的原生质体悬于高渗(T)缓冲液中，以备下一步对其进行原生质体诱变和原生质体融合时使用。

　　

　　

　　根据表中各水平极差数值进行分析，本研究中影响球红假单胞菌原生质体形成率的因素顺序为蔗糖浓度(12．3)>溶菌酶浓度(8．8)>EDTA浓度(6．4)>作用时间(5．7)；而影响球红假单胞菌原生质体再生率的因素顺序为蔗糖浓度(3．2)>溶菌酶浓度(2．9)>EDTA浓度(2．77)>作用时间(O．9)。蔗糖浓度对原生质体的形成与再生率的影响均居首位，反映出球红假单胞菌原生质体对渗透压具有相当的敏感性。

　　从表中各因素原生质体再生率平均值的最高值所对应的水平可以看出，制备球红假单胞菌原生质体的最适条件是蔗糖浓度为20％，溶菌酶浓度为O．5mg／mL，EDTA浓度为0．2％，反应时间为40min。上述最适条件制备球红假单胞菌原生质体，形成率为76．6％，再生率为9．8％，均高于表中的结果。

　　球红假单胞菌的酶解原生质体扫描照片如图5一l和图5—2所示。

　　



　　来源：北京标准物质网 www.biaowu.com 

　　来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com