球红假单胞菌、黄孢原毛平革菌的研究(一)

　　原标题：球红假单胞菌、黄孢原毛平革菌的跨界融合及其煤炭降解转化实验研究

　　1. 几种营养液、缓冲液和试剂的配制

　　(1) 0．01mol/L pH7．4磷酸盐缓冲液(PBS)：取0．25moL/L Na₂HPO₄85mL，0．25mol／L，KH₂PO₄ 15mL，NaCl 20g，用蒸馏水定容至2500mL。

　　(2) 0．05mol／L pH8．0 Tris-HCl缓冲液：0．2mol／L Trls 25mL，0．1 mol／L，HCl 25mL，用蒸馏水定容至100mL。

　　(3) 磷酸一柠檬酸缓冲液(P缓冲液)：Na₂HPO₄；·12H₂O  29．5g，柠檬酸1．85g，用蒸馏水定容500mL，pH7．O。

　　(4) SMM缓冲液：蔗糖0．5mm01／L，Mgcl₂ 0．02mm01／L，顺丁烯二酸0．02mmol／L，pH6．5。

　　(5) EDTA溶液：EDTA溶于P缓冲液中。

　　(6) 聚乙二醇(PEG．MW=6000)溶液：PEG溶于SMM缓冲液中。以上试剂使用前从0．07MPa湿热灭菌20min。

　　(7) Novonzyme234：购自sigma公司产品，溶于SMM缓冲液中，pH6．5，使用前抽滤除菌。

　　(8) 溶菌酶：购自sigma公司产品，溶于T缓冲液中．pH8．0，使用前抽滤除菌。

　　(9) 溶壁酶：购自广东微生物研究所，溶于SMM缓冲液中，pH6．5，使用前抽滤除菌。

　　2. 培养基

　　(1)基础培养基(g／L)：200g马铃薯浸出液，20g葡萄糖，20g琼脂，O．2mg CuSO₄，·5H₂O，8mg维生素B1，3．O K₂HPO₄，3．0KH₂PO₄，O．5(NH₄)₂N0₃，0．1 Na₂SO₃，O．1 MgSO₄·7H₂O，0．001MnSO₄；·4H₂0．0．0005 CaCl₂，O．2 FeSO₄·7H₂O，0．1酵母膏，10．0葡萄糖，5．0乙酸钠，蒸馏水1000mL，pH7．0。

　　(2)固体基础培养基：液体培养基+2％琼脂。

　　(3)高渗再生培养基：固体基础培养基+17％蔗糖。

　　以上培养基使用前以0．07MPa湿热灭菌20min。

　　(4)鉴别培养基：

　　鉴别1一基本固体培养基+200μ／mL 青霉素(Penlclmn，Pc)；

　　鉴别2一基本固体培养基+200μ／mL 制霉菌素(Nystatin，Nt)；

　　鉴别3一基本固体培养基+200μ／mL 青霉素+200μ／mL制霉菌素(Pc+Nt)。

　　(5)选择培养基：高渗再生培养基十青霉素和制霉菌素各200μ／mL，青霉素和制霉菌素用蒸馏水配成10000μ／mL的溶液，抽滤除菌后加入灭菌后的高渗再生培养基中。

　　3. 原生质体融合率

　　原生质体融合率=A／(B—C)×l00％

　　A：选择培养基平板上30℃培养4d后生长的菌落数；

　　B：两亲株原生质体在高渗再生培养基平板上，30℃培养4d后的菌落数；

　　C：两亲株原生质体在固体基础培养基平板上，30℃培养4d后的菌落数。

　　4. 菌种及其原生质体的制备

　　使用菌种：

　　(1)黄孢原毛平革菌；

　　(2)球红假单胞菌。

　　球红假单胞菌原生质体的制备优化条件如5-1所述。黄孢原毛平革菌原生质体的制备优化条件如5-4所述。

　　5. 融合子的药检检出

　　活化出发菌株和融合子后，以鉴别培养基制成倾注平板后，置于28℃培养箱内培养观察。出发菌株和融合子的抗生素抗性实验见表5—3，出发菌株和融合子的抗生素抗性实验图片如图5-12所示。

　　

　　

　　来源：北京标准物质网 www.biaowu.com 

　　来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com