球红假单胞菌、黄孢原毛平革菌的研究(二)

　　【来源/作者】北纳创联 

　　6. 球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌原生质体融和条件的优化

　　（1）原生质体融合最佳条件研究

　　按正交实验设计表．取PEG6000浓度、反应温度、CaCl₂浓度和作用时间四个因素，各因素分为3个水平．正交实验安排，试验因素及水平见表5—4。正交试验表头设计采用L₉(3⁴)。试验中不考虑各因素间的交互作用，实验结果见表5—5。

　　取球红假单胞菌与黄孢原毛平革菌的原生质体制备液0．5mL，混匀，10000r／min离心5min，弃去上清液，用SMM缓冲液洗涤双亲原生质体混合物3次后加入配置好的不同浓度的融合液，按照表5—4正交实验安排实验。实验终止后，10000r／min离心,’5min除去PEG，将沉淀用SMM缓冲液洗涤3次后悬浮在1mL SMM液中。将菌液涂布到选择培养基平板上，30℃培养4d后计算菌落数。同时将双亲原生质体混合物用SMM缓冲液稀释10⁶倍，分别涂布高渗再生培养基和固体基础培养基平板上，30℃培养4d后计算菌落数。

　　原生质体融合率一D／(E—F)×100％

　　D：选择培养基平板上 30℃培养4d后生长的菌落数；

　　E：两亲株原生质体在高渗再生培养基平板上，30℃培养4d后的菌落数；

　　F：两亲株原生质体在固体基础培养基平板上，30℃培养4d后的菌落数。
　　

　　

　　根据表中各水平极差分析，本研究中影响球红假单胞菌与黄孢原毛平革菌双亲原生质体融合率因素顺序为：钙离子浓度(3．13)>温度(2．65)>PEG浓度(1．92)>作用时间(1．54)。研究结果表明，增加钙离子的浓度可以显著地提高双亲原生质体融合率。另据报道，钙离子有助于增加细胞膜的通透性。因此，细胞膜的通透性对原生质体融合有显著影响。

　　根据表中各因素原生质体融合率平均值所对应的水平，双亲的最佳融合条件为：cap浓度50mmol／L，PEG浓度30％，温度30℃，融合时间10min。

　　以上述条件进行双亲原生质体融合，测得融合率为6．8×10^-6，略高于表中的结果。

　　（2）黄孢原毛平革菌与球红假单胞菌原生质体跨界融合子显微图片

　　黄孢原毛平革菌与球红假单胞菌原生质体跨界融合子显微图片如图5一13所示。

　　

 

　　来源：北京标准物质网 www.biaowu.com