核酸的鉴定与分析(二)

　　【来源/作者】北纳创联 

　　五、核酸印迹杂交

　　互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为杂交。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(或RNA)片段按碱基互补关系，形成杂交双链分子。

　　1. Southern印迹杂交

　　Southern印迹杂交是由凝胶电泳经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经固定再与相对应序列的已标记的探针进行杂交反应，用放射性白显影或显色反应检测特定大小分子的含量。该方法可用于克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(RELP)等。

　　2.  Northern印迹杂交

　　Northern印迹杂交由Southerm印迹杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定其中特定mRNA分子的含量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，如可推测出癌基因的表达程度等。

　　3.斑点杂交

　　斑点杂交是将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释，还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因诊断中经常用到。但由于目的序列未与非目的序列分离，不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时，难以区分目的序列信号和干扰信号。

　　4. 原位杂交

　　原位杂交是将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的方法。该方法可用于确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。荧光原位杂交(FISH)进行染色体DNA分析可用于生物学研究的许多领域以及临床细胞遗传学研究，其主要优点是不仅可以在细胞分裂的中期，而且可在分裂间期的细胞核中检测染色体的变化。

　　六、聚合酶链反应(PCR)

　　PCR是一种体外扩增特定DNA段的技术，基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤循环构成，随着循环的进行，前一个循环的产物又可以作为下一个循环的模板，使产物的数量按2ⁿ方式增长。从理论上讲，经过25～30个循环后DNA可扩增10⁶～10⁹倍。

　　除上述典型的PCR反应外，人们还根据各种用途设计了各种不同类型的特殊PCR，本节将重点介绍目前在分子克隆技术中应用最为广泛的反转录PCR和实时荧光定量PCR。

　　1. 反转录PCR

　　反转录PCR首先是在反转录酶的作用下从．RNA合成cDNA，即总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA(cDNA)。然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以dNTPs为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。反转录PCR是一种将cDNA合成与PcR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析，还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。对基因转录产物进行定性与定量的检测，相对传统的检测方法如Northern杂交、斑点杂交等，反转录PCR的精确度更高，且样品用量显著减少。利用反转录PCR对难检测的基因进行相应的检测与研究更易获得成功。另外，还能同时分析多个差别基因的转录。

　　2. 实时荧光定量PCR

　　为了能准确判断样品中某基因转录产物(mRNA)的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。Ct值的含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数，也可以理解为自增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。
　

　　实时荧光定量PCR包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

　　(1)探针法：探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同之处在于，在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的荧光标记探针，该探针根据需要扩增的靶序列设计，因此只能与待检测序列结合，与染料法相比特异性更高。

　　探针法的优点是特异性高，对探针的5’端采用不同的荧光标记就可以进行Multiplex定量PCR。探针法的缺点是实验成本较荧光法高，探针的使用需要设计及优化。

　　(2)染料法：利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量。该方法与常规的PCR类似，唯一的区别是在反应体系中加入了SYBR Green染料分子，能特异性与dsDNA结合并在497nm下激发。

　　染料法的优点是实验成本低，用方便，与常规PCR的操作几乎相同。染料法的缺点是由于SYBRGreen与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。而且，不能应用于Multiplex定量PCR技术。