浅谈PCR常见技术问题

　　【来源/作者】北纳创联 

 

　　PCR 实验中产物量过少？扩展产物出现杂带？条带大小与理论不符？等等，可能这些问题经常困扰大家的实验，今天小纳专门整理了一些这方面的问题以及如何处理的方法和技巧来和大家共同分享一下，希望小纳的努力能对朋友们的实验有所帮助哦！

一、PCR 实验中产物量过少

　　可能的原因以及对应的解决方案如下：

　　1.退火温度不合适。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。

　　2.DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。

　　3.PCR 循环数不足。增加反应循环数。

　　4.引物量不足。增加体系中引物含量。

　　5.延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。

　　6.变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。

　　7.DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA模板干净。

二、扩增产物跑电泳条带弥散

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　1.酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

　　2.dNTP 浓度过高。减少dNTP的浓度。

　　3.MgCl₂浓度过高。可适当降低其用量。

　　4.模板量过多。质粒 DNA 的用量应<50 ng，而基因组 DNA则应<200 ng。

　　5.引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。

　　6.循环次数过多；增加模板量减少循环次数至 30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。

　　7.退火温度过低。

　　8.电泳体系有问题：

　　①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；

　　②凝胶没有凝固好；

　　③琼脂糖质量差。

　　9.若为 PCR 试剂盒则可能：

　　①由于运输储存不当引起试剂盒失效；

　　②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

　　10.降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

三、扩展产物出现杂带

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　1.引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

　　2.循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

　　3.酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

　　4.退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

　　5.样品处理不当。

　　6.Mg²⁺ 浓度偏高，因适当调整Mg²⁺ 使用浓度。

　　7.若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

　　8.复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

　　9.反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

　　10.引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

　　11.引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

　　12.模板量过多。质粒DNA的用量应<50 ng，而基因组DNA则应<200 ng。

　　13.外源DNA污染。确保操作的洁净。

四、条带大小与理论不符

　　可能的原因以及对应的解决方案如下：

　　1.污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

　　2.模板或引物使用错误。更换引物和模板。

　　3.基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

五、阴性对照出现条带

　　可能的原因以及对应的解决方案如下：

　　1.试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

六、没有扩展条带

　　可能的原因及对应的解决方案如下：

　　1.酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

　　2.模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响 PCR 的结果。

　　3.变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

　　4.反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95℃ 加热 5~10 分钟。

　　5.引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

　　6.引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

　　7.DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和 PCR程序的问题。

　　今天跟大家分享的就这些PCR实验新手必备的常见问题及解决方法，您记住了吗？记得收藏我们的中国微生物菌种网站www.bnbio.com，我们会定期整理出部分大家咨询比较多的关于细胞和菌种培养的问题，供大家参考查询的。

 

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　　来源：北京标准物质网

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