微生物发酵法生产灵菌红素研究进展

　　1. 灵菌红素的合成途径及基因调控

　　关于灵菌红素在微生物细胞内的合成途 径、相关基因及代谢调控一直是科研人员努力 研究的方向，以期为灵菌红素的工业生产提供 足够的理论依据。目前普遍认为灵菌红素的合 成主要是由 pig 基因簇控制，通过两个分支途径 共同完成，这两个分支途径分别合成灵菌红素 的两个前体物质 (2-甲基-3-戊基吡咯(MAP) 和4-甲氧基-2,2-二吡咯-5-羧甲基乙醛 (MBC))，两 者再经一步缩合反应生成灵菌红素。下面将 对灵菌红素的合成基因簇、合成途径及相关基 因调控机制进行详细讨论。

　　1.1 合成基因簇

　　到目前为止，已有多个微生物的灵菌红素 合成基因簇被克隆、表达并测序，包括 Serratia sp. ATCC 39006 (S39006)、S. marcescens ATCC 274 (Sma274) 、 H. chejuensis KCTC 2396 (Hch2396) 和詹森杆菌 Janthinobacterium lividum strain BR01 (JliBR01) 等。其中Hch2396 的基因簇命名为 hap 基因簇，其他 3种微生物的基因簇均命名为 pig 基因簇。此外，S. marcescens FS14 和 S. marcescens WW4的 pig基因簇也被测序鉴定，其结构与 Sma274 的 pig基因簇非常相似。hap 基因簇和 pig 基因簇均 包含 13−15 个与灵菌红素合成密切相关的基因(如 S39006 的 pigA-pigO)，如图 1 所示。通过对 这些基因的序列比对发现，尽管来自不同的微生 物，但它们之间仍保持一定的序列相似性，其中，S39006和Sma274的pig基因簇相似性高达56.0%， 相似性最低的是 S39006 和 Hch2396 的基因簇，仅 为 28.4%，其余的相似性均在 30%−40%之间。

　　在基因的构成上，各个基因簇存在一定的 差异， S39006 的 pig 基因簇在 3′端比其他基因 簇多一个 pigO 基因，而且在其他基因簇中未发 现同源基因，Harris 等研究发现，pigO 并不直 接参与灵菌红素的合成，而是起到一定的调控 作用。此外， S39006 pig 基因簇两端的基因orfY 和 orfZ 也是该基因簇独有的，其中 orfY 编 码的蛋白包含吡啶核苷酸二硫键氧化还原酶结 构域，它与 NADH 氧化酶有较高的序列相似性， 而 orfZ 的功能仍然未知。Sma274 的 pig 基因 簇两端则是 cueR 和 copA 基因，Williamson 等 研究发现，cueR 和 copA 与细胞内铜稳态平衡 有关，当 copA 发生突变时，突变菌株对铜离子 更加敏感，而且灵菌红素的产量得到提升，因 此可以看出copA对灵菌红素的合成具有调节作 用。在 Hch2396 的 hap 基因簇的 3′末端存在 两个转录方向与hap基因簇相反的基因 (orf9和orf10)，它们与 Vibrio vulnificus 的组氨酸激酶和 应答调控子具有较高的同源性，因此，认为这两个基因可以调控 Hch2396 合成灵菌红素。JliBR01 的 pig 基因簇与其他基因簇最大的区别 是，pigB 与 pigC 及 pigJ 与 pigK 以融合基因的形 式存在，且在该基因簇中缺少 pigN 基因。

　　在获得灵菌红素合成基因簇序列的基础 上，研究人员对基因簇中各基因所编码的蛋白 质进行了序列分析及功能研究。Williamson 等对S39006 pig 基因簇中各基因进行基因敲除或片 段插入以构建相应的突变体，再通过液质联用(LC-MS)、营养共生 (Cross-feeding) 及遗传互 补 (Genetic complementation) 的方法分析各突 变体发酵过程中产生的中间产物，从而确定各 基因编码的蛋白在灵菌红素合成过程中的作 用，结果发现 PigB、PigD 和 PigE 参与了 MAP的合成，PigA、PigF、PigG、PigH、PigI、PigJ、PigM 和 PigN 参与了 MBC 的合成，而MBC和MAP 的缩合反应则由 PigC 催化实现，其中各蛋 白的功能见表 3。在上述蛋白中不包括 PigK和 PigL，因为两者并未直接参与灵菌红素的合成，其中 PigK 的作用是充当分子伴侣，协助一 种或多种参与合成 MBC 的 Pig 蛋白进行正确折 叠；PigL 的序列同源性分析显示该蛋白是一种4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，而在 MBC 合成 过程中存在磷酸泛酰巯基乙胺基的转移，在MAP 合成时则不存在该转移过程，因此将 PigK和 PigL 归属于 MBC 的合成途径。Sma274、Hch2396 和 JliBR01 的基因簇所编码的蛋白与S39006 的相应 Pig 蛋白相比，其序列的一致性远 远高于核酸序列的一致性 (表 3)，因此，它们与S39006 的 Pig 蛋白具有较高的同源性，在蛋白的 功能上也与 S39006 的 Pig 蛋白保持一致。

　　除了对 pig/hap 基因簇所编码的蛋白进行系 统性研究外，研究人员也对其中的某些蛋白进 行了深入的研究。例如，PigC 作为最终合成灵 菌红素的关键酶，通过序列比对发现其包含 ATP结合域和磷酸转移域，Chawrai 等对 Serratia 39006 的 PigC 和 H. chejuensis 的HapC进行了 克隆表达，并利用定点突变技术证实在 PigC 中，Glu-281、Arg295 和 His-840 是该酶结合 ATP 及 催化磷酸转移的关键氨基酸残基；底物特异性 研究发现 PigC 除能够催化 MAP 和 MBC 的缩合 反应外，还可以催化两者的结构类似物之间的 缩合反应，最终生成灵菌红素结构类似物，为 合成新的灵菌红素类色素提供了理论基础。此 外，包括 PigE、PigF、PigI 和 HapK 在内的多个 蛋白的晶体结构得到解析，从而能够更好 地理解该蛋白在灵菌红素合成过程中的作用。

　　1.2 生物合成途径

　　1.2.1 MAP的合成

　　MAP 的合成途径如图 2 所示。该途径以脂肪酸合成或不饱和脂肪酸自氧化过程中产生的2-辛烯醛为起始前体，在 PigD 的作用下与丙酮 酸反应，其中，PigD 与乙酰乳酸合成酶同源， 可以催化丙酮酸脱羧，并将脱羧后的 2C 单元与2-辛烯醛结合生成 3-Acetyloctanal；再由具有氨 基转移活性的 PigE 催化合成氨基酮，氨基酮自 环化形成环亚胺 H2MAP；最后，H2MAP 在 PigB的催化下氧化脱氢形成 MAP。

　　1.2.2 MBC的合成

　　MBC 的合成以 L-脯氨酸为起始底物，在PigI 的作用下，L-脯氨酰基与 PigG 中的巯基结 合形成复合物 L-脯氨酰-S-PigG，再经 PigA的催化下氧化脱氢得到吡咯-2-羧基-S-PigG，然后 吡咯-2-羧基单元从 PigG 转移至 PigJ 活性中心 的半胱氨酸得到吡咯-2-羧基-S-PigJ，同时PigH从一分子丙二酰辅酶 A 中夺取了丙二酰基，形成了复合物丙二酰基-S-PigH，该复合物脱羧后 进攻吡咯-2-羧基-S-PigJ 的硫酯键，生成了一种 与 PigH 相连接的吡咯-β-酮基硫酯复合物，在PigH 的作用下吡咯-β-酮基硫酯与丝氨酸反应生 成 4-羟基-2,2′-二吡咯-5-甲醇(HBM)，HBM 在PigM 的催化下羟基被氧化成醛基得到 4-羟基-2,2′-二吡咯-5-甲醛 (HBC)，最后，HBC 的羟基 在 PigF 和 PigN 的作用下被甲基化生成 MBC， 合成途径如图 2 所示。

　　1.2.3 MAP 与 MBC 的缩合 灵菌红素合成的最后一步即为 MAP 和MBC 的缩合，催化该反应的酶是 PigC，反应过 程如图 2 所示。Chawrai 等对该过程的反应 机理进行了解析：MBC 和 ATP 首先与 PigC 相 结合，分别进入该酶的催化中心及 ATP 结合域， 然后 PigC 的磷酸转移域夺取 ATP 的磷酸基团， 结合了磷酸基团的转移域进攻 MBC 的醛基，使 醛基活化后，MAP 进入催化中心与MBC 发生缩 合反应，最终生成灵菌红素并释放出磷酸基团。

　　1.3 合成基因簇的转录调控

　　灵菌红素合成基因簇的转录受多种因素联合 调控，包括微生物本身的多个基因表达调控系 统：群体感应系统和双组分系统，此外还包括 多种调控蛋白。各调控系统和调控蛋白的作用 及相互之间的联系如图 3 所示。

　　1.3.1 群体感应系统

　　群体感应 (Quorum sensing) 是细菌根据自 身的细胞密度变化进行基因表达调控的系统， 其基本原理是细菌通过感受自身在繁殖过程中 分泌的某种信号分子，当该信号分子达到一定 阈值时，细菌会启动某些基因的表达。研究表明，S39006 合成灵菌红素的过程受群体感应 系统的调控，该系统主要由 smaI 和 smaR 两个 基因组成，其中 SmaI 的作用是合成信号分子N-酰基-高丝氨酸内酯类 (AHLs) 化合物，当细 胞密度较小时，AHLs 浓度较低，SmaR 与 pig基因簇相结合，从而抑制该基因簇的转录；随 着细胞的生长，AHLs 的浓度不断增大，当 AHLs浓度达到一定值时可以抑制 SmaR 结合 DNA 的 活性，使 pig 基因簇得到转录表达，细胞开始合 成灵菌红素。在 S. marcescens SS-1 合成灵 菌红素的过程中 SpnI 和 SpnR 构成了其群体感 应系统。

　　1.3.2 双组分系统

　　双组分系统(Two-component regulatory systems)是微生物为适应不同的环境变化而建立的基因 表达调控体系，该系统主要由传感器激酶蛋白 和应答调节蛋白组成.研究发现，灵菌红素 的合成至少受4个双组分系统的调控：PigQ/PigW、PhoB/PhoR、RssB/RssA 和 EepR/EepS。Fineran 等 研究表明，在 PigQ/PigW 双组分系统中，PigW作为传感器激酶蛋白，PigQ 作为应答调节蛋白， 当 PigW 感应到某一生理信号时促使 PigQ 磷酸 化，磷酸化的 PigQ 促进 pig 基因簇的转录，从 而促进灵菌红素的合成。当 pigQ 和 pigW 发生 突变时，pig 基因簇的转录水平和灵菌红素的产 量都有所下降，因此，认为 PigQ/W 双组分系统 对灵菌红素的合成具有正调控作用。PhoB/PhoR 是 S39006 合成灵菌红素的另一个正 调控双组分系统，该系统与细胞内磷酸盐 (Pi)含量有关。EepR/EepS 是最新发现的一个具 有正调控作用的双组分系统，其中 EepR 可以促 进 pig 基因簇的转录，但是 EepR 的表达受环腺 苷酸受体蛋白 (cAMP receptor protein，CRP) 的 抑制，因此，对灵菌红素合成基因簇而言，CRP是一种间接负调控蛋白。在 4 个双组分系统中，RssB/RssA 是唯一一个具有负调控作用的系统， 其中的应答调节蛋白 RssB 磷酸化后会阻碍 pig 基 因簇的转录。

　　1.3.3 其他调控机制

　　除了上述的调控系统外，灵菌红素合成基 因簇的转录还受到多种蛋白的调节，主要包括PigP、PigT、PigX、HexS、PigS、PigR 和 PigV等，其中 PigP 是 1 个多功能转录调控因子，它 不仅直接调节灵菌红素合成基因簇的转录，还 对其他多种调控蛋白的转录具有调节作用(图3)。PigT 是一种 GntR 家族转录因子，可以 促进 pig 基因簇的转录，但是当环境 (培养基)中存在葡萄糖酸盐 (Gluconate) 时，PigT 的DNA 结合活力会被抑制，从而削弱其对 pig 基 因簇转录的激活作用。PigX 是一种环二鸟苷 酸 (c-di-GMP) 磷酸二酯酶，包含一个GGDEF/EAL 结构域，该结构域与细胞合成c-di-GMP 有关。研究发现，当 pigX 发生突变时，细胞内 PigA 和 PigF 的表达水平显著提高，灵菌 红素产量比野生型菌株提高 350%，因此，PigX是一种灵菌红素合成基因簇转录抑制因子。HexS 是 LysR 家族转录因子，对 pig 基因簇的转 录起负调控作用，其主要调控机理是与 pigA 上游 序列相结合，抑制 pig 基因簇的转录。PigS 属 于 SmtB/ArsR 家族的转录抑制因子，Gristwood等研究发现 pigS 基因两端含有两个独立的操纵 子 (blhA-orfY 和 pmpABC)，该操纵子的表达产 物会抑制灵菌红素的合成，而PigS 可以抑制这 两个操纵子的转录表达，因此，对于灵菌红素 合成而言，PigS 是一种间接正调控因子，同时，PigP 对 pigS 的转录具有促进作用。此外，还 包括 PigR 和 PigV 两种调控蛋白对灵菌红素的 合成具有调节作用，其中 PigR 是一种腺苷酸环化 酶，PigV 是一种内膜蛋白，两者都可以促进灵菌 红素的合成，但其作用机制尚未得到解析。

　　2. 结论与展望

　　灵菌红素作为一种重要的天然色素，近年 来随着灵菌红素的应用范围不断扩大，其巨大 的市场潜力也不断显现，只有实现灵菌红素的 大规模工业化生产才能满足人们对其的需求。 目前灵菌红素的合成研究主要集中在微生物发 酵方面，以上关于灵菌红素高产菌株选育、发酵及提取工艺优化和生物合成途径及基因表达 调控机制解析等方面的研究为灵菌红素的工业 化生产奠定了坚实的基础。

　　然而，发酵法生产灵菌红素工业化进程的关键瓶颈在于较低的产 量和产率，为进一步加快微生物发酵法生产灵菌红素的进程，今后的研究应该从以下几个方面展开：1) 继续选育高产菌株：目前灵菌红素 的发酵研究主要集中在沙雷氏菌属，自然界这个微生物多样性巨大宝库尚未完全打开，从自然界中筛选稳定高产的灵菌红素产生菌仍然是 提高灵菌红素产量的有效方法；2) 继续深入研究灵菌红素合成途径中的关键酶：灵菌红素的生物合成涉及 10 多个酶的催化，各个酶的催化 机制及其在灵菌红素合成过程中的重要性并未完全揭示，利用基因工程技术提高关键酶的活性有利于灵菌红素的产量；3) 代谢工程改造： 目前，代谢工程技术应用在微生物生产灵菌红素的研究鲜见报道，通过代谢工程改造可以增强灵菌红素合成基因簇及其正调控因子的转录 表达，抑制或削弱负调控因子的表达，从而有效提高微生物的灵菌红素产量；4) 发酵和提取工艺优化：继续优化灵菌红素发酵条件，采用 原位分离发酵技术提高灵菌红素的产率。

　
　　来源：北京标准物质网 www.biaowu.com

　　来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com