《食品微生物检测方法确认技术规范》（三）

6．确认试验用菌株的选择

微生物自然污染的样品有时很难得到，因此确认试验中常使用目标菌接种制备人工污染食品样品。对于一个属水平的方法，应尽可能使用不同种或不同血清型的菌株，并且每个食品类型都应接种有代表性的不同种或不同血清型的菌株。加工食品中的微生物是典型的受损伤菌．因此，对这些类型的食品进行人工污染的微生物也应该是受损伤的。可把未受损伤的微生物接种到未加工食品中，把冻于菌种接种到于粉或粒状食品中，把湿润菌株接种到潮湿食品中。

如果一种方法用来检测通常在所有的食品类型中都不易发现的特定菌株，或者根据参考文献，某类食品的目标微生物不在检测水平内，也可以接种培养物制备人工污染样品进行试验。人工污染后的食品样品应小心处理，保存在合适的条件下，使微生物在分析前保持稳定。

在试验样品中添加目标菌的同时，还应考虑竞争菌群的添加。竞争菌群的存在使微生物检验更符合实际和更具挑战性。加入竞争菌群可使食品样品最接近于自然状态，其足以证实某类食品中目标微生物的部分回收率。竞争菌群的污染水平应比目标微生物至少高一个对数级。

7．定性方法实验室内确认试验的接种水平、对照、测试样品数量

每一种食品至少分成两份，一份作为阴性对照，另一份在保证部分回收的水平上接种，～般情况下，根据检测方法的最低检测限设定低接种水平，例如：每份检测样品lCFU／25g～5 CFU/5g。如果需要，推荐制备一份高接种水平样品，设定为每份检测样品10CFU／25g～5CFU／25g，而这～水平是唯一可接受的部分回收率的要求。其他接种水平可根据需要增加。一个以上接种水平可以提高每一接种水平部分回收的概率，在测定方法的最低检测限时测试结果全部阴性或阳性的接种水平是没有意义的，不符合方法确认要求。每一接种水平的测试样品数量是20份。即每一种类食品应测试60个样品(3个类型×20个样品)。

8．定量方法实验室内确认试验的接种水平、对照、测试样品数量

对于人工污染的食品．要求有高、中、低3个接种水平(例如：10²CFU/g~10³ CUF/g、10⁴CUF／g、10⁵CUF／g)和一个未接种对照。对每个接种水平和阴性对照，都要用待确认方法和基准方法各检测j个样品。低接种水平应设定在检测限左右，中、高接种水平应当分别高1和2个对数级。如有必要，可加做中间水平以提高精密度。

9．定性方法实验室内确认试验的自然污染样品

每个自然污染的食品类型至少需要2批。应努力获得自然污染样品，这些产品最大程度的代表了方法使用的真实环境。对于这些自然污染样品，没有阴性对照。要分析20份由每批自然污染制品而成的样品，如果所有的20份都是阳性，可将样品稀释以获得部分阳性，并重复分析该批样品。

同时制备人工污染样品和未接种的对照样品。如果从阴性对照样品中检出目标菌阳性，表明可能发生了交叉污染，则该测试结果无效，此时需要进行重复测试。对照样品不包括自然污染食品。

1 0．定量方法实验室内确认试验中人工和自然污染样品的使用

要求大约50％的食品类型为自然污染。除非目标菌为某一种特定微生物，而这种微生物可能极少发生自然污染各食品种类。对于自然污染的食品，要求每个食品类型做3个不同的批次。自然污染的食品类型不要求未接种对照。食品类型应既有自然污染的样品又有人工污染的样品。

11．灵敏度和特异性

灵敏度是待确认方法从众多菌中检测到目标菌的能力。特异性是待确认方法对可能引起交叉反应的相关非目标菌的抗干扰能力。灵敏度和特异性的数据可以用来证实某个方法能够检测目标菌的主要血清型而对相关的不同属和／或种不反应。至少选择50株目标微生物菌株和30株竞争菌株来分析方法的灵敏度和特异性。

12．实验室间协同试验

实验室间协同试验是申请为标准的微生物学方法必须进行的试验，在完成实验室内确认试验后进行。实验室间协同试验的目的在于确定不同实验室使用相同的样品进行检测所得到结果的差异．从而对方法的性能指标作出实际的估计，特别是当该方法在实际应用过程中出现预期的系统及随机误差时。

协同试验每种食品类型至少需要8个协作实验室的数据，涉及贵重仪器或对实验室有特殊要求时，最少应在5个实验室进行，所采用的基准方法与食品种类的要求与实验室内确认试验要求一致。实验室间协同试验的测试样品由组织实验室制备统一，并尽可能结合璧用人工和自然污染样品，如没有自然污染样品，可以使用人工污染的样品，人工污染样品的接种水平与实验室内确认试验一致。定性方法协同试验每一种食品类型每一接种水平馘6个样品，定量方法协同试验每一种食品类型每一接种水平做2个样品。