温度敏感突变株的筛选

  温度敏感突变株(简称温敏突变株，Ts突变株)是一种条件致死突变株，它们在许可溫度下能正常生长，在非许可温度下不能生长。温敏突变株主要由必需基因突变引起，也可由非必需基因突变产生。由后者形成的Ts突变株在非许可温度下生长时，需要补充其他条件。

TS突变株与某些基因产物的结构改变有关，即酶的氨基酸序列发生了一定的变化，但酶的活性中心未变。温敏突变株在许可温度下培养时，酶的活力、菌体生长和代谢都正常，当菌体生长到一定阶段。转到非许可温度时，可使突变体由正常状态转入具有某些特性的非主长状态，导致细胞某些结构改变，从而使发酵目的产物得以不断合成和往外分泌。

(1)温敏突变株的筛选方法温敏突变株最常见的基因突变是错义突变，即结构基因上碱基发生转换或颠换，引起氨基酸序列改变。除了错义突变外，二次移码突变、结构基因末端缺失、结构基因无义突变等也可产生温敏突变株。由于这些基因突变后造成酶结构异常，在高温时失活，引起细胞结构改变。

由于温敏突变株主要由错义突变所致，因此，选择诱变剂时要选择易于引起基因置换的重硝基类、磺酸酯类或亚硝酸、紫外线等诱变剂。

在诱变后的存活菌体中温敏突变株的数量很少．大部分为野生型菌株，因此，要采取一些措施，淘汰野生型菌株．富集温敏突变株，以提高温敏突变株的筛选效率。常采用以下几种富集方法。

①抗生素法将诱变后的菌体在非许可温度下培养一定时间后．加入抗生素，可杀死野生型菌株，但不能杀死未曾生长的温敏突变株。离心除去抗生素后．进行分离筛选。

②过滤或离心法某些温敏突变株是DNA复制缺损或孢子萌发缺损的突变株．它们在非许可温度下培养到一定时期，细胞伸长成丝状，或芽枝不脱落母细胞，致使密度增加．可用薄膜过滤或密度梯度离心等方法富集。

③H3一前体法要富集某些大分子合成缺损的温敏突变株，可以加入相应的H3一前体物质。如筛选RNA合成缺损的温敏突变株，可把诱变后的菌体在非许可温度下培养，并加入H3一尿嘧啶，此时RNA缺损TS突变株不能合成RNA，也不吸收H3一尿嘧啶，而野生型可吸收H3一尿嘧啶，并将其渗入RNA。含H3一RNA的细胞在长时间低温保存过程中由于射线损伤而死亡，但RNA合成缺损的TS突变株则能保存下来。

同样，蛋白质合成缺损或磷脂合成缺损TS突变株可在非许可温度下培养时加入H3一氨基酸或H3一甘油磷酸，从而达到富集。

经过诱变和富集后的微生物群体中温敏突变株的数量虽然已较多，但仍然是多种微生物的混合体，因此，要把温敏突变株从群体中筛选出来。具体筛选方法如下：将经过富集后的菌体分离于CM上，置于30℃下培养，当菌落长出后，用影印法将菌落分别复印到一个CM和两个MM平板上，分成两组(图4．38)。其中一个MM平板为一组，置于许可温度(如30℃)下培养；另一组MM和CM平板各一个，置于非许可温度(40℃)下培养；根据菌落生长情况，可以筛选到两类温敏突变株。

一类是由非必需基因突变引起的温敏突变株，在30℃的MM上生长，而在40℃的MM上不生长，但在40℃的CM上生长。说明该类突变株从CM中补充了某种生长因子后才得以生长，是一类由突变引起失去单一但可以补偿功能的温敏突变株。另一类是由必需基冈突变引起的温敏突变株，在30℃的MM上生长。而在40℃的MM和CM上都不生长，说明该类突变株即使从CM中提供了某种生长因子也无法补偿失去的功能。通常温敏突变株是指后一类。

也可将诱变处理后的菌株直接涂布舅基本培养基上，先在非许可温度下培养·长出的菌落为野生型菌株，作下记号．然后置于许可温度下培养，新长出的菌落有可能是温敏突变株。进一步验证，并纯化：

(2)温敏突变株在发酵工业中的应用

①温敏突变株在谷氨酸发酵的应用 谷氨酸发酵中增加谷氨酸产量的关键，决定于细胞膜的渗透性。选育细胞膜结构或功能缺损的温敏突变株，可以通过调节温度来控制细胞瞠的渗透性，促使谷氨酸大量外泄。

②温敏突变株在丝氨酸发酵中的应用 以cl化合物为唯一碳源的微生物，合成细胞组分是通过丝氨酸途径来实现的(图4．39)。从图4．39可以看出，要提高丝氨酸产量关键在于阻断丝氨酸降解途径。在丝氨酸生产过程中曾采用一些抑制剂，提高了丝氨酸的转化率，即当丝氨酸产生菌生长到一定阶段，加入8一羟基喹啉、2．2一联吡啶、CO ²⁺或Ni ²⁺等，以抑制丝氨酸残余的降解活力。但这种外加药物的方法用于工业生产并不是理想方法。选育丝氨酸降解酶温敏突变株，在许可温度下，丝氨酸产生菌具有正常的丝氨酸降解活力，能利用甲醇生长繁殖。当温度上升到非许可范围时，产生菌失去丝氨酸降解作用，因而能大量分泌丝氨酸。

(3)温敏突变株在微生物单细胞蛋白生产中的应用 生产单细胞蛋白的菌种，除含有高蛋白质特性外，还要具有两个特点：①生长迅毫．底物利用率高；②菌体细胞壁易破碎、容易自溶，且细胞易于沉降，便于分离纯化．有益于动物消化利用。

对于生产单细胞蛋白的菌种，现已筛选到一些具有特色的温度敏感突变株。例如DNA复制缺损的TS突变株，在许可温度下培养时菌体形态和生长都正常，但当温度上升到非许可温度培养时，细胞形态开始发生变化。细胞伸长，从母细胞上长出的芽也变长，且不脱落．继续培养，细胞和芽凝聚成丛状，易于凝集沉降。又如易于自溶的TS突变株，在许可溫度下培养时，生长正常。当细胞生长繁殖达到最大量时，调节温度到非许可状态，继续培养．菌体细胞发生自溶，此时释放到细胞外的蛋白质含量占细胞总蛋白质的30％，而亲株仅2％。另外，筛选蛋氨酸含量高的TS突变株，能提高单细胞蛋白的营养价值。

TS突变株用于工业发酵生产的前景十分诱人。例如筛选三羧酸循环缺陷温敏突变株，透过温度控制阻断三羧酸循环，提高柠檬酸等有机酸产量。

筛选合成代谢酶缺失的温敏突变株对发酵工业特别有利。这种温敏突变株在许可温度下培养时酶活力正常．不需要添加生长因子。当菌体生长到一定阶段，将温度升高到非许可条件下，此时合成代谢酶活力下降或完全消失，不能合成终产物，使反馈调节被解除，因此中间产物能不断地被合成和积累。

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