细胞培养常用培养液及试剂

  维护体外细胞的生存、生长及进行细胞培养各项操作均需要使用大量的液体，主要包括手衡盐溶液、消化液、天然培养液和人工合成培养液。

一、平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)

平衡盐溶液(BSS)主要由无机盐和葡萄糖配制而成，是组织细胞培养中常用的基本液棒．可以维持渗透压、调节酸碱平衡及为提供细胞生存所需的能量和无机离子成分。BSS既可用于组织、细胞的洗涤，也可作为制备合成培养液的基础液。

BSS是从：Ringer生理盐水发展起来的，即Ringer是最简单的BSS。Earle溶液含有较高的NaHCO₃(2．2g／L)，适用于5％CO₂的培养条件，Hank’s溶液仅含0．35g／L NaH—CO₃．若用于5％CO₂的培养则溶液会迅速变酸；D—Hank’s与Hank’s主要区别在于前者不舍有Ca ²⁺ 、Mg ²⁺ ，常用于配制胰酶溶液；Dulbecc0可考虑用于配制一些有特殊要求的消化液；目前较常使用的BSS是Hanks液、Earle液和PBS液。

BSS可用双蒸水或去离子水配制，若配方中含有Ca ²⁺ 、Mg ²⁺ ，应首先溶解这些成分。配好的．BSS可经过滤除菌或高温高压灭菌处理后，4℃保存备用。

二、消化液

进行原代组织培养时，需将组织块消化解离制成单细胞悬液．传代培养时需要利用消化液将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，常用的消化液有胰蛋白酶溶液、乙二胺四乙酸(EDTA)及胶原酶溶液，可以分别单独或混合使用。

(一)胰蛋白酶溶液

蛋白酶是一种黄白色粉末，易受潮，应密封放置阴暗干燥处。它的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使贴壁细胞从瓶壁上脱落，细胞游离分散。常用浓度为O．25％或5％，pH值为7．2左右。胰蛋白酶分散细胞的活性与细胞种类、细胞特性有关。不同种类、不同数量的细胞采用胰蛋白酶消化的时间不同。一般浓度大、温度高、新配制的胰蛋白酶可使细胞分离速度增快。但是超过一定限度的消化作用会损伤细胞，胰蛋白酶在pH8．0 37℃时作用最强。胰蛋白酶溶液的配制需应用无Ca ²⁺ 、Mg ²⁺溶液配制，终止消化时可加入一些含血清的培养液。

5％胰蛋白酶溶液配制方法：

1．称取0．5g粉状胰蛋白酶，溶于100ml无Ca ²⁺ 、Mg ²⁺液体(D—Hank’s)或．PBS中。

2．置4℃过夜使其溶解，或磁力搅拌混匀后，使其充分溶解。

3．过滤除菌，分装备用。

(二)EDTA溶液

EDTA乙二胺四乙酸溶液EDTA是一种化学螯合剂，毒性小，对贴壁细胞有离散作用。一般使用浓度为0．02％。配制时采用无Ca ²⁺ 、Mg ²⁺平衡盐溶液充分溶解，高压灭菌后备用。

(三)胰酶一EDTA消化液

将胰蛋白酶和EDTA联合使用，分散细胞的效力会更高。但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。胰酶一EDTA消化液二者的终浓度分别为0．25％胰蛋白酶液和O．02％EDTA液，滤过除菌，分装后备用。

(四)胶原酶溶液

胶原酶(collagenase)是从溶组织梭状细胞芽胞杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，可采用胶原酶解离细胞法。胶原酶仅对细胞问质有消化作用而不易损伤上皮细胞。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。胶原酶的使用浓度为O．1～0．3mg／L，最佳作用pH为6．5。胶原酶不受Ca ²⁺ 、Mg ²⁺及血清抑制，配制时可用PBS。

胶原酶分为l、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。

1.胶原酶I用于上皮、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动物细胞的分离。需要注意的是I型胶原酶分子颗粒比胰酶大．不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。

2．胶原酶Ⅱ适用于肝、骨、甲状腺、心脏和唾液腺等组织。

3．胶原酶Ⅲ型对哺乳动物的组织有广泛的消化作用。

4．胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68～130KD不等。它能消化多种组织。

5．胶原酶V可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。

(五)透明质酸酶溶液

透明质酸酶可降低细胞间质的黏性，可与胶原酶或胰蛋白酶混合使用，用于消化细胞间基质，多用于原代细胞的培养。通常根据需要配置浓度。

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