细胞脱核技术

(一)原理

细胞脱核技术指人工将核从细胞中除去的一项新技术。以10mg／L的浓度细胞松弛素B(cytochalasin B；CB)处理，可使99％的细胞发生脱核，形成无核细胞质体(cytoplast)和无胞质的核质体(nucleoplast)，可用于做多种研究，如细胞融合、胞质、胞膜、胞核的成分分析以及开展染色质基因转移技术等。

(二)材料

1．CB液的准备：将cB溶于二甲基亚砜中(DMSO)，即1ml CB加lml DMSO作为母液，4℃可存放三年，使用时以1：100加入培养基中，使其最终浓度为10μg／ml。

2．细胞培养液：含10％小牛血清的RPMI 1640或MEM培养液。

3．培养用的塑料圆板的处理：用无毒的塑料圆板，厚度需l～1．5rnm大小可随离心管直径大小而定，只需比离心管口径略小1～1.5mm，圆板两侧要有两个凹陷以便用镊子挟取，为了便于圆板的支撑和平衡离心，在离心管中加人一个圆筒状的塑料垫圈，垫圈高2～2．5cm，周边厚度为2cm，其外径应与圆板的大小相当，使其与离心管的口径略小，在离心管中可方便插入和取出，离心前应先把垫圈投入离心管中，把圆板稳固地扣盖在垫圈上(令其细胞朝下)，然后加入CB液略超过圆板，以浸没细胞。离心管可用高压灭菌，塑料圆板垫圈可用⁶⁰Co辐照．也可用95％酒精浸过夜，取出用无菌蒸馏水漂洗2～3次，用紫外线对其两面照射20～30min或更长后，即可使用。

(三)方法

1．用能贴壁生长的单层细胞，取数个塑料圆板置人平皿中，接种已制备好的细胞悬液，置37℃，5％CO₂培养。

2．待细胞形成单层时，在无菌条件下将细胞圆板扣盖在离心管的垫圈上，令细胞面向下，加入CB(10mg／L)培养基，使其淹没圆板为宜，为了防止圆板离心时翻转，在圆板上再放人同直径的圆柱形垂锤。

3．以12000 r／mm离心15～20min，可使99％细胞的核被脱掉，形成无核细胞质体和无胞质的核质体。

4．离心脱核后，沉于管底的为胞核，圆板上的细胞为脱核的胞质体，用PBS漂洗2次，每次1～2min，可置人培养液基(不含cB)继续培养，使细胞恢复原先的正常形态。

(四)结果观察

取出固定染色，也可进行细胞融合及染色质导人试验，或将胞膜、胞浆分离进行成分分析，或开展膜结构研究。沉于管底的核，因核周围仍包有薄层胞质和CB，可采用培养液漂洗1～2次，然后用于融合，或将核中染色质导入另一新细胞，或吸出涂片，固定，染色，制成标本。

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