染色排除法检测细胞活力

1)训练目的

了解细胞活性检查的原理；掌握染料的配制方法；掌握细胞活性检查方法。

2)实验原理

细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止这类染料进入细胞内，因此可以鉴别死细胞与活细胞。常用的染料有台盼蓝、苯胺黑、结晶紫。

3)实验材料

①台盼蓝、苯胺黑、结晶紫溶液(溶于Hank's液或BSS液)。

②冷冻复苏后的细胞或其他培养细胞。

③研钵、滤纸、漏斗、试剂瓶、标签纸、显微镜、胶头滴管、镊子、载玻片、盖玻片、计数器。

4)操作步骤

(1)配制染色液

①0.5％台盼蓝法：0.5g台盼蓝加热溶于100 mLHank's液或BSS液中，贴标签。

(1)0.05％苯胺黑：0．05 g苯胺黑充分研磨后溶于100 mL Hank's液或BSS液中。苯胺黑对细胞毒性小，但溶解度差．配制后需过滤，贴标签。

③0.1％结晶紫(用BSS液配制)法：0.1g结晶紫分别研磨溶于．100mL Hank's液或BSS液中，过滤后贴标签。

(2)制备细胞悬液

调整细胞浓度在1×10⁶个／mL左右。

(3)染色

①0．5％台盼蓝法：取少量细胞悬液，按l：1量加入0．5％台盼蓝染色液，充分混匀。静置15 min，用胶头滴管吸取细胞悬液，滴1滴于载坡片上，加盖玻片。1 min后用10x物镜移动视野观察，计数100～200个细胞。活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞活力。

②0．05％苯胺黑法：使用时，苯胺黑液与细胞悬液以1：10混合，稍放置后镜检，死细胞染成黑色，活细胞不着色。

③0.1％结晶紫法：细胞悬液与结晶紫液等量混合后，立即镜检，着紫色的为活细胞。

5)注意事项

①染色时间不能太长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色，使检测结果偏低。

②可结合细胞计数方法，同时进行细胞计数和活力检测。

③细胞活性检查是细胞培养的基本技术。它是检测不同药物、生化物质处理等效果的直观简便手段，也是评定细胞冷冻效果的方法之一。在细胞冻存和复苏过程中，由于细胞遭受非生理性的低温打击等，不可避免地对细胞产生影响，引起部分细胞活力下降或死亡，通过细胞活性检查可快速检验细胞冷冻效果，是衡量细胞冻存、复苏效果的一种简便易行的方法：染料排除法是检查细胞活性常用的方法。

④检查贴壁的细胞时，应先将细胞消化然后再进行操作。

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