细胞爬片培养细胞的固定

细胞爬片的制备是免疫细胞化学、免疫荧光、TUNEL凋亡检测的第一步，也是获得一份好的实验结果的关键步骤。

操作步骤如下所述。

(1)爬片的准备

①爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片。

②将盖玻片根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用小砂轮(输液用于打开玻璃安瓿瓶或是用于口腔科的小砂轮)，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。若是接种大皿，一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

③将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第2天先用自来水冲洗20遍，然后置于无水酒精中浸泡6 h，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

④高压灭菌后取出放人烤箱中烤干，备用。烤干后可放人超净工作台中。

(2)细胞爬片

①细胞经胰酶消化后计数并重悬细胞于完全培养基中：

②加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基(目的是使 玻片与培养皿靠培养基的张力黏合到一起)，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成 双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。

③根据需要选择合适的细胞密度种入培养板内。

④待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

⑤按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张 力较大，可用注射器针头针尖将爬片轻轻勾起，用小镊子取出。如果要做如24 h、48 h、72 h 等时间点的实验，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子，未取出的可继续培养。

(3)细胞爬片的固定

细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS清洗不 是必须步骤，如做凋亡的TUNEI。染色时就应避免洗，因为凋亡的细胞在清洗的过程中有可能会脱落。

在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般一20℃保存2—3个月的片子做免疫组化是没有问题的。

(4)常用的固定液

①冷丙酮：冷丙酮常用于一般的免疫组化染色。

将纯的丙酮预先放入冰箱一20℃冷冻后成冷丙酮(丙酮在此温度不会凝固成固体)细胞爬片取出后，PBS洗2遍，加入冷丙酮于一20℃(丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发)固定10 min。取出后，室温吹干，然后放入一20℃保存。

②多聚甲醛(常用4％)：多聚甲醛固定的细胞爬片可用于免疫电镜，也可用于免疫荧光以及TUNEI。染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胞分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

室温固定15 min后，将表面液体吹干，于一20℃保存。

③95％乙醇：95％乙醇可用于免疫组化的细胞爬片的固定，其优点是穿透性强、抗原性保存较好。而缺点是醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

室温固定15 min后，将表面液体吹干，于一20℃保存。

④甲醛：甲醛又称福尔马林，其应用最广。其优点是形态结构保存好，且穿透性强。而缺点是甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

室温固定15 min后，将表面液体吹干，于一20℃保存。 


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