放线菌个体形态观察的方法

(一)基本原理

放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层，基丝在下层；气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直线形、波曲形、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据，为了能观察放线菌的形态特征，人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征并进行观察。本实验介绍其中几种常用方法。

1．扦片法

将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。

2．玻璃纸法

玻璃纸是一种透明的半透膜，将灭菌的玻璃纸覆盖在琼脂平板表面，然后将放线菌接种于玻璃纸上，经培养，放线菌在玻璃纸上生长形成菌苔。观察时，揭下玻璃纸，固定在载玻片上直接镜检。这种方法既能保持放线菌的自然生长状态，也便于观察不同生长期的形态特征。

3．印片法

将要观察的放线菌的菌落或菌苔，先印在载玻片上，经染色后观察。这种方法主要用于观察孢子丝的形态、孢子的排列及其形状等。此方法简便，但放线菌的形态特征可能有所改变。

(二)器材

菌种：5406放线菌或青色链霉菌；弗氏链霉菌。

培养基：灭菌的高氏l号培养基。

仪器及其他用具：石炭酸复红染液，载玻片，显微镜等；经灭菌的玻璃纸、盖玻片，玻璃涂布棒、接种铲、接种环、小刀、镊子。

(三)操作步骤

1．扦片法(图5一1)

(1)倒平板 将灭菌后的高氏1号培养基(冷却至大约50℃)倒人培养皿，每皿倒15mL左右，凝固后备用。

(2)接种 用接种环挑取菌种斜面培养物(孢子)在琼脂平板上划线接种。划线要密一些，以利于扦片。

(3)扦片 以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约45°角扦入琼脂内(扦在接种线上)，扦片数量可根据需要而定。

(4)培养 将扦片平板倒置，28℃培养，培养时间根据观察的目的而定，通常3～5d。

(5)镜检 用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检。观察时，宜用略暗光线，先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。如果用O.l％美蓝对经培养的盖玻片进行染色后再观察，效果会更好。

2．玻璃纸法

(1)倒平板(同扦片法)。

(2)铺玻璃纸 以无菌操作用镊子将已灭菌(155～160℃干热灭菌2h)的玻璃纸片（似盖玻片大小)铺在培养基琼脂表面，用无菌玻璃棒(或接种环)将玻璃纸压平，使其紧站在琼脂表面，玻璃纸和琼脂之间不留气泡。每个平板可铺5～10块玻璃纸。也可用略小于平皿的大张玻璃纸代替小纸片，但观察时需要再剪成小块。

在玻璃纸灭菌时，若直接将于燥的玻璃纸灭菌，玻璃纸就会缩小，不便使用。故需作如下处理：将玻璃纸和滤纸剪成培养皿大小的圆形，用水浸泡后把湿滤纸和玻璃纸交互重叠地敦在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。

(3)接种 用接种环挑取菌种斜面培养物(孢子)在玻璃纸上划线接种。

(4)培养将平板倒置，28℃培养3～5d

(5)镜检 在洁净载玻片上加一滴水，用镊子小心取下玻璃纸片，菌面朝上放在玻片的求滴上，使玻璃纸平贴在玻片上(中间勿留气泡)。先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。操作过程勿碰动玻璃纸面上的菌培养物。

3．印片法

(1)接种  培养用高氏l号琼脂平板，常规划线接种或点种，28℃培养4～7d。也可用上述两种方法所使用的琼脂平板上的培养物，作为制片观察的材料。

(2)印片  用接种铲或解剖刀将平板上的菌苔连同培养基切下一小块，菌面朝上放在一载玻片上。另取一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气丝、孢子丝或孢子)附着(印)在后一块载玻片中央，有印迹的一面朝上，通过火焰2～3次固定。印片时不要用力过大，以免压碎琼脂；也不要挪动，以免改变放线菌的自然形态。

(3)染色  用石炭酸复红覆盖印迹，染色约1min后水洗。

(4)镜检  干燥后，用油镜观察营养菌丝的形态。

来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com