生物指示剂

    一、定义

    生物指示剂，简称为BI，是对特定灭菌工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂，适用于制备生物指示剂的微生物多为芽胞类细菌，这是因为，除辐射灭菌外，芽胞类细菌比常规的生长态微生物对灭菌工艺具有更强的耐受性。生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。

    二、组成形式

    目前，常用于灭菌工艺验证的生物指示剂主要有三种形式，它们都是用对特定灭菌工艺具有一定耐受性并已知其种类的微生物芽胞制备而成。有些生物指示剂可能含有两种不同类微生物，并且两种微生物的含量也不相同。

    (一)芽胞条将芽胞加在载体上，如接种于滤纸片、玻璃／塑料等薄片或条状物，并用特定的材料包起来以保持其完整性和生物活性，俗称芽胞条。此类指示剂比较适用于验证和监控非溶液类物品的灭菌工艺。

    (二)芽胞悬浮液芽胞悬浮液可被接种于代表性的待灭菌产品溶液或模拟产品溶液中。可用此芽胞悬浮液直接接种于产品内或产品外表面，这样能更加直观地考察产品的实际灭菌效果；如果芽胞悬浮液不宜被直接接种于产品内(或外)，则可用模拟产品替代，但要注意的是，芽胞在模拟产品内(或外)的耐热性不得比在实际产品内的低，否则将影响到灭菌工艺验证或日常监控的可靠性。因此，在使用此类生物指示剂之前，务必测定芽胞在产品或模拟产品内(或外)的数量、D值、Z值以及存活时间和死亡时间。

    (三)自含型生物指示剂这种指示剂的一种形式是将芽胞条(或片)加入到含有指示剂的培养基包装内(如：小瓶内)，这些培养基事先单独包装并与芽胞载体分离，经灭菌处理后，挤碎培养基小瓶使芽胞条(或片)浸没在培养基内，在适当温度和时间内培养，通过观察培养基内的酸碱指示剂的颜色变化判断其生长状况；另一种形式是将芽胞直接接种在含有指示剂的培养基内，经培养后生长的微生物使pH值发生变化，引超颜色变化来以指示是否有微生物生长(图2—3)。自含型生物指示剂的耐热性与其载体、包装的材质、结构有很大的相关性。生物指示剂的包装要易于杀菌剂透过，因此，测定D值时务必要考虑这些因素，尤其是包装可能会引起杀菌效果的滞后，因此，不能仅测定芽胞条(或片)的D值。
 

    商购的生物指示剂应附有相应的质量报告资料(质检证书)，以确保生物指示剂符合其每签上标示的性能要求。质检证书的内容应至少包括：D值、微生物含量、存活时间、死亡对同、有效期以及产品的最佳使用、贮存和培养条件等。表2—5列举了常用生物指示剂的典型特性。
 

 

    有资料提议，当生物指示剂经受挑战试验后，宜在4小时内培养。尽管有人认为可以延长挑战试验与培养之间的时间间隔，但是，从质量保证角度来看，我们应当尽可能地在较短时间内培养经受挑战后的生物指示剂。每个企业应根据自身的条件和特点制定适当的时间限度。

    有两种方法可用来判断生物指示剂的芽胞生长状况，一种是通过肉跟观察培养基的颜色变化(酸碱指示剂)或浊度变化来判断是否呈阳性；另一种则是借助于相差显微镜观察，在相差显微镜的视野中，生长态细胞呈现暗色，而芽胞则呈现亮色。

    对一特定的灭菌工艺而言，笔者建议尽可能购买同一类型的生物指示剂，这样可以大大减少实验室花费在生物指示剂的质量复核及灭菌工艺验证评价方面的工作量。

    三、制备

    如必要用环境中的分离菌来验证灭菌程序时，有条件的微生物实验室可自行制备生物指示剂，包括选种、大规模芽胞培养、收集芽胞、纯化和保藏等。菌种储备液内不得含有营养性物质以保证芽胞始终处于休眠状态。对自制生物指示剂芽胞的贮存条件和贮存时间应予验证，以确保芽胞数量和D值的稳定性。

    实验室自制生物指示剂时，应按生物指示剂生产商的规范要求制备生物指示剂。有关生物指示剂的记录均应具有可追溯性，如种源、转种时间、传代代数、培养及制芽胞用培养基和芽胞收集前后的热处理方式等。参照实验室菌种制备、保藏和使用要求管理灭菌工艺用生物指示剂。

    四、生物指示剂的选择和使用

    我们知道，一种生物指示剂不是万能的，要根据灭菌方式及工艺条件选择适当的生物指示剂。事先要了解生物指示剂对相关灭菌工艺的耐受性能，以保证所用生物指示剂的挑战性大于自然存在于产品内(或外)的微生物的挑战性。

    研究表明，生物指示剂对灭菌工艺的耐受性，不仅取决于生物指示剂本身，而且也取决于灭菌时其所处的环境条件，如生物指示剂包装材料对杀菌剂的穿透效果，芽胞溶液的RH值、粘度、金属离子的浓度等都是生物指示剂耐受性的主要影响因素。为了确保生物指示剂在产品灭菌程序开发、验证和日常监控中的有效使用，务必要充分了解相关产品的组分及其包装材料的性能。如采用过度灭菌工艺(能使产品中最耐热微生物的数量下降12个对数单位以上，则需要确保所用生物指示剂赋予产品灭菌工艺的挑战效果大于产品中实际污染菌的挑战性。如果因产品对灭菌条件敏感而无法采用过度灭菌工艺，则要根据灭菌前产品的含菌量资料来制定合理的灭菌工艺条件和选择适当的生物指示剂。生物指示剂在湿热灭菌工艺验证中的具体应用，请参见第十二章“热力学灭菌工艺的微生物学验证”。

    (一)湿热灭菌用生物指示剂 下列芽胞杆菌常用于湿热灭菌工艺的验证与监控(表2一6)。
 

    (二)干热灭菌用生物指示剂 干热灭菌工艺常采用由枯草芽胞杆菌芽胞制备而成的生物指示剂来监控。不过，内毒素挑战去热原工艺验证常被用来替代生物指示剂验证，这是因为内毒素比微生物芽胞更难杀灭。实践证明，一个能使细菌内毒素下降至少3个对数单位的干热灭菌工艺可确保被灭菌物品的非无菌概率小于10^-6。

    (三)离子辐射用生物指示剂曾经用短小芽胞杆菌芽胞监控离子辐射工艺，但现在已很少使用。因为现在的辐射灭菌工艺多采用剂量设定法，而不需要再用生譬指示剂监控。况且，被灭菌物品中的有些污染菌对辐射的耐受性比短小芽胞杆菌还要强。

    (四)环氧乙烷灭菌用生物指示剂在环氧乙烷灭菌工艺中，常采用枯草芽胞杆菌的亚种，即枯草芽胞杆菌黑色变种的芽胞作为生物指示剂来对该工艺进行监控。

    (五)汽态过氧化氢(VPHP)灭菌用生物指示剂现已证明，过氧化氢蒸气(VPHP)是一种高效的表面消毒剂或杀菌剂。如果工艺条件控制严格并且被灭菌物品的构造及排列得当，过氧化氢蒸气可达到灭菌要求(非无菌品的概率小于10^-6)。然而，过氧化氢蒸汽也常t用作表面消毒剂，多用于无菌生产的洁净室、隔离系统、以及无菌试验的表面消毒处理。

    表面消毒工艺与药品的灭菌工艺截然不同。表面消毒只是为了将环境中的微生物杀灭而不致被检出。我们也常用生物指示剂来考察表面消毒的效果。但是，USP26 认为，表面消毒工艺只要能使生物指示剂下降3～4个对数单位就足够了，因为这毕竟是消毒而不是灭菌。

    常采用嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞确认过氧化氢蒸气(VPFP)的消毒，灭菌工艺。但也可用梭状芽胞杆菌芽胞或枯草芽胞杆菌芽胞，当然还可选用其他类的微生物芽胞，只要证明其对VPHP，的耐受性不低于上述3种芽胞的耐受性。

    用于过氧化氢蒸气(VPHP)消毒／灭菌工艺验证的芽胞，可接种于气体易于穿透的载体上，如玻璃、金属或塑料等材质。但是，不得将芽胞接种于对过氧化氢具有高度吸附性的材曩(如纤维)上，因为这样势必会改变过氧化氢蒸气(VPHP)对芽胞的实际作用浓度。也不可采用纸质材料，因为过氧化氢对含有纤维素的材料具有降解作用。

来源：北纳细胞网 www.bncc.org.cn