培养基灌装验证(一)

    由于绝大多数厂家选用培养基对无菌生产工艺进行验证，并且其中又包括多种方法。本文重点介绍目前较为通用的方法，即采用液体培养基(或营养肉汤)进行灌装模拟试验。

    一、培养基灌装试验的频率

    新建无菌工艺生产线或生产工艺发生重大更改后，每个班次必须经至少连续3批合格的培养基灌装试验后方可证明被验证工艺的可靠性。

    常规生产条件下的再验证频率：每年至少两次，每次每个班次至少灌装一批。

    如果因培养基灌装试验不合格而重新灌装，灌装时间(班次)要与初始灌装的时间(班次 )相同，灌装批次(1~3批)依调查结果而定。

    二、模拟试验中必须注意的方面

    1．尽可能地模拟日常实际生产时的所有关键工艺过程，设备运行方式与常规生产相同：当一条生产线生产多种产品时，可将各种最高风险因子组合在一起，如用最大敞口容器、最低灌装速度、冻干的装卸过程模拟、以及非密封容器的最长允许放置时间等。

    2．模拟试验须尽可能地模拟实际生产中的最差状况，包括在一个班次中可能会碰见的所有干扰和维修活动。

    3．灌装体积一般说来，每只容器的培养基灌装体积不得少于其总容积的．1／3，这样才能保证有足够数量的培养基与容器的内表面充分接触并且易于观察到微生物的生长状况；培养基也不能灌满容器，以保证容器内有足够氧气，同理，容器内不要冲氮气等惰性气体(即使产品有此要求)。

    4．灌装数量确定培养基的灌装数量时要考虑以下两个主要因素。一是培养基的灌装数量应符合统计学要求，即在95％的置信限至少能检出1‰的污染率；二是被验证工艺的日常实际生产批量，因为实际生产批量与无菌工艺操作所持续的时间和灌装速度密切相关，而培养基灌装的持续时间应足以涵盖实际生产条件下的全部操作，并且培养基的灌装数量应能反映出在等于或小于实际生产时的灌装速度下产品及容器所暴露时间的“最差状况”。因此，当某无菌生产线的实际生产批量大于3000瓶时，则培养基的灌装批量不得少于3000瓶；当无菌生产线的实际生产批量最多不超过3000瓶时(包括临床试验产品)，则按日常最大批量灌装培养基即可。

    5．培养基的灌装模拟试验应安排在一周的不同日期内进行，灌装时间要涵盖实际生产时间。

    6．如果在不同房间内有相同的生产线，则要对每条生产线进行灌装。

    7．此外，为便于查找污染源，最好能将整个无菌工艺过程拍摄下来，并将盛装容器的托盘做好次序标记等。

    三、培养基的选择

    培养基灌装的目的是为了尽可能地检出无菌生产工艺系统中可能会给实际产品造成污染的微生物，因此，用于无菌工艺验证的培养基应符合以下质量要求：

    1．尽可能适应广谱微生物的生长，包括细菌、真菌和酵母菌等。验证试验前，可用下述方法来鉴别验证用培养基的可行性。严格按照培养基生产商的要求进行配制和灭菌。将无菌培养基分装至一定数量的无菌小瓶或试管内。同时，制备好3种微生物[枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌]的悬浮液，菌液浓度控制为100~1000／ml。将上述准备好的无菌培养基分成3等份，且每份至少两瓶(或支)，分别向其中加入上述菌悬液各0．1ml。将接有枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基于30~35℃下培养，接有白色念珠菌的培养基于20～25℃下培养。如果在7天内，每种微生物培养基均至少有50％出现长菌，则认为该培养基可用于无菌工艺验证试验。并且，在灌装和培养结束时，还要进行灵敏度检查。

    2．培养基浓度须符合培养基供应商的使用说明要求。

    3．具有较好的澄明度培养基的澄明度较高，有助于检查出受污染的浑浊培养基。

    4．可除菌过滤如果无菌工艺需使用除菌过滤器，则无菌工艺验证用培养基也应在生产线上模拟除菌过滤程序。

    四、无菌培养基的制备

    对于产品溶液与培养基溶液配制方法相似的无菌生产线来说，可用培养基替代产品组分完全模拟实际生产时的配液操作情况进行培养基配制(按培养基生产商的要求配制)，除菌过滤、并将除菌后的培养基溶液接入一无菌接收罐。

    对于那些产品溶液配制方法与培养基溶液配制方法不同或是生产粉针剂的无菌生产线来说，可按照下述方法制备无菌培养基。在洁净区内，将事先称量好的培养基加入一无菌的洁净配制罐内，按照培养基生产商的要求加入适量的注射用水进行配制，充分搅拌直至培养基完全溶解，调节培养基溶液的pH值至规定范围( pH 7.2 ± O.2 )。在一无菌环境条件下，用一无菌管路将配制罐与已灭过菌的装有0.22μm滤膜(或滤芯)的过滤器的进口端连接起来；无菌操作，用一无菌软管将除菌过滤器的出口端与一无菌的储罐(储罐顶部的通气口应配有 0.22μm 的疏水性过滤器)连接起来；通过加压或减压将培养基溶液经除菌过滤后转移至无菌储罐内。过滤结束后，检查除菌过滤器的完好性，如果过滤器的完好性检查结果合格，则无菌培养基制备完成。

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