培养基灌装验证(二)

    五、无菌灌封

    由受过培训的无菌生产操作人员模拟实际灌装作业进行培养基灌装。灌装容器及胶塞应尽可能与常规产品生产时的一致(但对粉针生产线来说，可能要额外装配适当的液体灌装头)。容器、胶塞和灌装设备的关键部件以及装瓶用托盘容器均应按照既定的标准操作规程进行清洗和灭菌。灌装时，最好能模拟实际生产时的最差状况，如设备维修、操作人员的更换等，以掌握在实际生产条件下产品污染的真实资料。根据不同剂型，分别按下述方法进行灌装模拟试验。

    (一)液体制剂需要进行培养基灌装模拟试验的液体制剂主要包括：玻璃瓶或塑料瓶装针剂、塑料瓶装滴眼剂和滴耳剂以及安瓿产品等。

    灌装前，应按药品生产时所允许的最大时间保存无菌培养基；如果药液有冷藏要求，则要对培养基模拟该程序。灌装时，在各自的液体产品生产线上按生产时的最低速度灌装无菌培养基，灌装后直接压塞或熔封。值得注意的是，有些塑料容器因透明度不高而影响结果观察，须采取额外措施进行检查；如果是非透明容器，则要将内容物例出来检查。

    (二)粉针剂有两种方法适用于粉针剂的无菌灌装模拟试验。一种方法是在灌装线上直接灌装无菌液体培养基；第二种方法，在向容器内加入稀释剂(注射用水或液体培养基)之前或之后，在无菌灌装线上往容器内灌入培养基粉末或惰性粉末。常用的惰性材料有聚乙二醇8000和羧甲基纤维素等。

    (三)悬浮剂此类产品的生产工艺与液体制剂相似，不同之处在于它需要不断搅拌或循环流动以保持组分处于悬浮状态。因此，在进行培养基灌装模拟试验时，需要模拟此过程。如果在灌装前需要无菌操作添加物料，那么，在进行模拟试验时，也得用培养基或惰性材料模拟此过程。

    (四)冻干剂灌装过程与液体制剂类似。但是，在灌装后只进行半压塞，模拟实际操作将半压塞瓶转移至冻干机内。培养基的冷冻温度不得低于3℃，因为温度过低会使一些微生物死亡或受到损伤，造成污染水平降低的假象，不能如实反映无菌工艺的实际无菌保证水平。模拟冻干时，适当进行部分真空而不需充氮保护(请注意，真空度不宜过高，否则会引起培养基暴沸；充氮会抑制需氧性微生物的生长)。冻干结束后，在腔室内全压塞，然后卸出并转移至压盖间压盖。将压盖后的培养基上下颠倒几次以使培养基与胶塞及整个容器内壁充分接触。从灌封至最终的培养检查，应将盛装培养基瓶的托盘容器做好标记，以便于对所出现的偏差进行追溯。

    (五)半固体制剂(如无菌软膏) 模拟试验时，宜按照常规生产工艺将液体培养基增稠到适当粘度。可用琼脂和羧甲基纤维素作为增稠剂，也可选用其他试剂，但要证明其没有抑细菌或抑真菌作用。装软膏用的塑料或金属管无法检查培养基是否被污染，因此，在培养结束后，需将培养基挤出来并置于适当容器(培养皿)内检查其混浊度和真菌菌落，或进行无菌检查。也可采用培养基遇到污染物会变色的方法来替代上述检查，但替代方法需经过验证。

    (六)无菌散装药品建议对无菌散装药品的生产工艺进行培养基灌装模拟试验。但是，散装药品的生产工序比成品制剂复杂，通常包括多个步骤，因此，要考虑每个步骤对微生物污染的风险，而且，有些步骤无法使用培养基。

    六、培养条件和计数检查

    (一)培养和检查一般将培养基倒置(便于和整个容器的内表面接触)于20~25℃下培养14天，每隔7天检查1次。也可先于加。25℃培养7天，再于30～35℃下培养7天。培养期间，也可定期检查培养基，记下每次检出的污染瓶数及出现污染菌的相应托盘编号。检查时将每瓶培养基在有光源的黑色和白色背景下仔细目测。透明、澄清、无混浊的培养基判为无微生物生长；如培养基混浊或有悬浮的菌丝或菌落，则需作进一步的微生物生长检查，以确定培养基是否真正染菌。

    (二)记数对已确定有微生物生长的培养基瓶进行仔细检查，看其中是否有破损，有破损的培养基瓶不得纳入最终的结果评价。每批灌装培养基的污染率可按下式计算：

    七、污染菌的鉴别

    将污染瓶中的污染菌在适当的培养基(如大豆胰蛋白胨琼脂、营养琼脂等)上划线和分离培养。挑取单个菌落进行形态学观察、革兰染色等初步鉴别。如果需要对培养基灌装结果作进一步调查，那么将污染菌鉴别到种，这对偏差调查起到非常关键的作用。寻找污染菌与其他资料(如环境监控资料和录像资料等)间的相关性是无菌工艺偏差调查的有效手段。

    八、培养基灵敏度检查

    从每批培养后检查好的培养基中随机抽取适量，按照药典现行版附录Ⅺ无菌检查法(或美国药典<71>无菌检查法)中的培养基灵敏度检查法检查培养基的灵敏度，可分别向培养基中接人下列试验菌悬液，每个菌株至少接种两瓶灌装培养基，每瓶接种量为10~100个菌，除表13一1中所列标准菌株外．还应增加灌装时的环境分离菌检查培养基的灵敏度，将接有微生物的培养基置于相应温度下培养(环境分离细菌于30．35℃培养，真菌于30～35℃培养)，每种菌株在七天内应至少有50％出现明显生长，否则，可复试1次。如果灵敏度检查结果不合格，该批培养基灌装试验无效，须重新验证。

来源：北纳细胞网 www.bncc.org.cn