细胞培养常用消化液的配制方法

     一、消化液的配制

     经常使用的是胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，传代时用以使细胞脱离附着底物表面和离散成单个细胞。它们可以单独使用，也可按一定比例混合一起使用，这主要根据细胞的要求，可自行试验以做取舍。从经济和使用方便考虑，因EDTA易获得和易配制，可以选择作为常用的消化液。

     1．胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存。主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的，经常使用的有 1：125 和 1：250 的两种浓度，即1份胰蛋白酶能分别解离125份或250份酪蛋白。胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的类型和细胞的特性有密切关系。不同的细胞系对胰蛋白酶溶液的浓度、温度和作用时间等的要求也不一样。一般来讲，浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞分离能力也越大，但超过一定的限度也会损伤细胞。胰蛋白酶溶液在 pH 8．0，温度为37℃时，作用能力最强。此外，许多学者认为，Ca²⁺ 、Mg²⁺ 和血清中蛋白质的存在会降低其活力。所以常用无 Ca²⁺ 、Mg²⁺ 的溶液配制。消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对细胞的继续作用。

     在国外的生产厂家的目录中．除我们常用的较为粗制的混合型胰蛋白酶外，还有从中提取纯化的各种亚型的精制胰蛋白酶产品，它们对某种特定组织解离作用较强，可以用于特殊需要．但价格较为昂贵。胰蛋白酶溶液的配制方法如下。

(1)将D-Hartks 液或 Duldecco 盐溶液高压消毒灭菌，用 NaHCO₃ 液调节pH至 7.2 左右。

(2)称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐溶液，搅拌混匀，置室温4h或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡。

(3)次日先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0．25％或0．125％；胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调pH至7.2左右。2．EDTA溶液：EDTA是一种化学螯合剂，其溶液又称VerSen液，对细胞有一定的解离作用，并且毒性小，价格低廉，使用方便。使用浓度一般为0.02％，但某些个别细胞系要求浓度较高。用无钙、镁盐溶液溶解后，高压蒸气灭菌，分装成小瓶，室温或4℃冰箱保存。

     3．胶原酶溶液胶：原酶在上皮类组织原代培养时用于组织细胞的解离，作用的对象是胶原组织，不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0．1～0 3mg~／L或200 000U／L，作用的最佳州为6．5。胶原酶不受Ca²⁺ 、Mg²⁺ 及血清的抑制，配制时可用 PBS。

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