大肠杆菌质粒DNA的制备

　　【来源/作者】北纳创联 

　　1、碱裂解法

　　碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的醋酸钠／醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质．SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。碱裂解法是较常用的质粒DNA提取方法，其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。

　　2、煮沸裂解法

　　细菌用溶菌酶、TritonX-100及加热裂解，染色体仍然附着在细胞膜上，经简单的离心就可以将它们沉至管底，再用异丙醇将质粒从上清液中沉淀。该方法十分快捷，但制备的DNA的质量比碱裂解法差。

　　3、锂沉淀法

　　用氯化锂方法来提取质粒DNA就是基于两种核酸在氯化锂溶液中的溶解度有所不同，RNA和蛋白质在高浓度氯化锂溶液中形成沉淀，染色体DNA也会连同细胞碎片一起沉淀，小分子质粒DNA则留在溶液中，通过高速离心加以分离。该方法可靠快捷，操作简单，制各的DNA的纯度高和质量好，可用于各方面的实验。

　　4、氯化铯／溴化乙啶平衡离心法

　　该方法是纯化大量质粒DNA的首选方法。在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。氯化铯／溴化乙啶密度梯度离心法，就是根据这一差别建立的纯化质粒DNA的经典技术。当将含有溴化乙啶的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，溴化乙啶便会通过在碱基对之间的嵌入作用而结合在DNA分子链上，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，例如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合相当大量的溴化乙啶分子。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA分子，溴化乙啶分子的结合数量相对较少。在DNA．溴化乙啶复合物中，结合的溴化乙啶分子数量越多，其密度也就越高。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。

　　5.柱层析法

　　层析法的工作原理分两种，一种是利用疏水反应纯化核酸；另一种是利用混合离子交换及吸附反应进行纯化。后者是制备用于转染真核细胞质粒DNA的最常用方法。商品化的层析树脂一般分为两大类，一类树脂纯化的质粒DNA其纯度足以用于酶操作(如PCR、限制酶反应和连接反应等)和原核细胞转化．但不适用于真核细胞转染；另一类纯化的质粒．DNA适用于以上所有用途。

　　6. 聚乙二醇沉淀法

　　采用聚乙二醇(6000或8000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的聚乙二醇的浓度也不同。聚乙二醇的浓度低，选择性沉淀DNA相对分子质量大，大分子所需的聚乙二醇的浓度只有1％左右，小分子。DNA所需聚乙二醇浓度高达20％。通过控制聚乙二醇浓度可以选择性沉淀DNA，其分辨率大约为100bp。该办法快速、可靠、方便，可以在任何步骤时终止，并且DNA回收完全。既不涉及离心，又避免了溴化乙啶的使用。

　　在上述方法中，碱裂解法、煮沸裂解法和锂沉淀法可用于质粒DNA的快速小量制备。其中碱裂解法和煮沸裂解法还可用于大量制备粗制质粒DNA，之后进一步通过氯化铯梯度离心法、层析法或聚乙二醇沉淀法进行纯化。